檢視重组质粒的原始碼

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| style="background: #008080" align= center|  '''<big>重组质粒</big> '''
 
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[[File:200911210964.jpg|缩略图|居中|[http://www.bio-equip.com/imgatl/200911210964.jpg原图链接][http://pic.sogou.com/d?query=%E9%87%8D%E7%BB%84%E8%B4%A8%E7%B2%92&forbidqc=&entityid=&preQuery=&rawQuery=&queryList=&st=&did=1来自 搜狗 的图片]]]
 
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有目的基因，[[有质粒]]，然后用酶使两者相接就是[[重组质粒]]，重组质粒是一个种动作，方法，也是一个名词。

=='''基本信息'''==

质粒具有稳定可靠和[[操作简便的优点]]。如果要克隆较小的DNA片段(<10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子

=='''反应策略'''==

'''带有非互补突出端的片段'''

外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：

1、带有非互补突出端的片段 用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的黏 [1]  性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。

'''带有相同的黏性末端'''

2、带有相同的黏性末端 用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。 由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入大肠杆菌（E. coli）受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。

'''带有平末端'''

3、带有平末端 是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比黏性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。

'''特殊情况下'''

外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。<ref>[https://news.sina.com.cn/o/2006-01-04/03537886978s.shtml  “表达凝血八因子新的重组质粒”成功研制],新浪网2006年1月4日, </ref>
==参考文献==
{{reflist}}

[[Category:360 生物科學總論]]