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| 皮膚干細跑 | |
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皮膚干細跑，是人體最大的器官，它被覆於身體表面，由表皮、真皮、皮下組織及附屬器組成。在抵禦微生物入侵、紫外線輻射以及防止水分的丟失、調節體溫和維持人的外貌等方面起着十分重要的作用。
皮膚有極強的修復和再生能力，這與皮膚幹細胞的存在具有直接的關係。雖然目前對皮膚幹細胞的位置、種類和數量報道不一，但研究較多的主要有表皮幹細胞(Epidermal stem cells)和毛囊幹細胞(follilar stem cells)。[1]
基本介紹
表皮幹細胞是各種表皮細胞的祖細胞,來源於胚胎的外胚層,具有雙向分化的能力。一方面可向下遷移分化為表皮基底層,進而生成毛囊;另一方面則可向上遷移,並最終分化為各種表皮細胞。
表皮幹細胞在胎兒時期主要集中於初級表皮嵴,至成人時呈片狀分布在表皮基底層。表皮幹細胞在組織結構中位置相對穩定,一般是位於毛囊隆突部皮脂腺開口處與豎毛肌毛囊附着處之間的毛囊外根鞘。
表皮幹細胞與定向祖細胞在表皮基底層呈片狀分布，在沒有毛髮的部位如手掌、腳掌，表皮幹細胞位於與真皮乳頭頂部相連的基底層;在有毛髮的皮膚，表皮幹細胞則位於表皮基部的基底層。其中有1%~10%的基底細胞為幹細胞。[2]
不同發育階段的人皮膚表皮幹細胞的含量不同。胎兒期表皮基底層增殖細胞均為表皮幹細胞和短暫擴增細胞，而少兒表皮基底層中部分細胞為表皮幹細胞和暫時擴增細胞，成人表皮幹細胞和暫時擴增細胞所占比例則進一步降低。
相關細胞
毛囊是皮膚附屬物之一，多位於真皮。由於最初在毛球部發現有顯著的細胞分裂，因而早期人們認為毛球是細胞分裂及毛囊生長期起始的重要部位。1990年，Cotsarelis等對小鼠皮膚進行HTdR摻入實驗，4 周后發現毛母質細胞不含有標記而95 %以上的毛囊隆突部細胞仍保持標記。
同時形態學上看，隆突細胞體積小，有捲曲核，透射電鏡檢查發現其胞漿充滿核糖體,而且缺乏聚集的角蛋白絲，細胞表面有大量微絨毛，是典型的未分化或"原始狀"細胞。因而提出了毛囊幹細胞定位於隆突部。隨後的多個實驗進一步支持了毛囊幹細胞定位於隆突部的理論。
(二)皮膚幹細胞的生物學特性
表皮幹細胞最顯著的是慢周期性(slow cycling)、自我更新能力以及對基底膜的粘附。
①慢周期性在體內表現為標記滯留細胞(label-retaining cell)的存在，即在新生動物細胞分裂活躍時參入氚標的胸苷，由於幹細胞分裂緩慢，因而可長期探測到放射活性，如小鼠表皮幹細胞的標記滯留可長達2年。表皮幹細胞慢周期性的特點足以保證其較強的增殖潛能和減少DNA複製錯誤;
②表皮幹細胞的自我更新能力表現為在離體培養時細胞呈克隆性生長，如連續傳代培養，細胞可進行140次分裂，即可產生1×1040個子代細胞;
③對基底膜的黏附，其主要通過表達整合素來實現黏附過程，而且不同的整合素作為受體分子與基底膜各種成分相應的配體結合。
表皮幹細胞對基底膜的黏附是維持其自身特性的基本條件，也是誘導幹細胞脫離幹細胞群落，進入分化周期的重要調控機制之一。此外，體外分離、純化表皮幹細胞也是利用幹細胞對細胞外基質的黏附性來進行的。
毛囊幹細胞最重要的特點之一也是慢周期性，而且可以有無限多次細胞周期。一個完整的毛囊周期要經過生長期、退化期和休止期。在毛囊生長期時，位於隆突部的細胞可快速增殖，產生基質細胞，進而分化出髓質、皮質和毛小皮等。
而後，毛基質細胞突然停止增殖，進入退化期。最後毛乳頭被結締組織鞘遷拉，定位於毛囊底部，在毛囊處於休止期時，通過毛乳頭上移，使毛囊進入下一個循環。
儘管已經在皮膚表皮、毛囊中發現有幹細胞的存在，但目前一些研究學者對確定皮膚幹細胞的最終來源仍存在爭議。
(三)皮膚幹細胞的分離
皮膚幹細胞的分離主要利用發現的相對特異的表面標誌(如整合素家族成員和角蛋白家族成員)結合流式細胞術進行。
(四) 皮膚幹細胞的鑑定
利用皮膚幹細胞一些相對特異的標誌建立了一系列的皮膚幹細胞鑑別方法。最初，一些學者是從研究細胞黏附特性入手的。他們發現，在表皮基底細胞定向分化時，它會失去其對基底膜蛋白的黏附性，而這種黏附性是受細胞表面受體-整合素家族調控的。
整合素為異源雙聚體，包括α和β兩種亞基。在基底層細胞定向分化過程中，β1整合素表達下調，直至細胞完全脫離基底層，其細胞表面β1整合素才喪失表達，故β1整合素可作為表皮幹細胞的一個表面標誌。
表皮幹細胞高度表達3 種整合素家族的因子:α2β1 、α3β1和α5β1。另外，β1整合素高表達也可作為毛囊幹細胞的一個表面標誌;
角蛋白(Keratins)是表皮細胞的結構蛋白,它們構成直徑為10nm的微絲,在細胞內形成廣泛的網狀結構。隨着分化程度的不同,表皮細胞表達不同的角蛋白，因而角蛋白也可作為幹細胞、定向祖細胞以及分化細胞的鑑別手段。
表皮幹細胞表達角蛋白19(K19)，定向祖細胞表達角蛋白5和14(K5和K14)，而分化的終末細胞則表達角蛋白1和10(K1和K10);有實驗結合表皮幹細胞表面的α6整合素及另一個與增殖有關的表面標誌10G7，可以區分幹細胞與定向祖細胞。
α6陽性而10G7陰性的細胞處於靜息狀態,在體外培養中具有很強的增殖潛能，認為是表皮幹細胞。而α6與10G7均陽性的細胞是定向祖細胞，體外培養證實其增殖能力有限;有p63 (一種與p53 同源的轉錄因子)也可區分人類表皮幹細胞和暫時擴大細胞。表皮幹細胞分化為暫時放大細胞後p63 表達量迅速減少,連續培養的表皮幹細胞可維持p63 分泌。
(五)皮膚幹細胞的臨床應用
皮膚幹細胞的臨床應用主要表現在幾個方面:(1)在細胞替代治療中的應用。當皮膚受到外傷、疾病等的損傷時，位於皮膚表皮基底層和毛囊隆突的皮膚幹細胞就會在內外源因素的調控下，及時增殖分化生成相關細胞，以修復機體受損表皮、毛囊等結構。
特別是大面積Ⅲ度燒傷、廣泛瘢痕切除、外傷性皮膚缺損以及皮膚潰瘍等導致的嚴重皮膚缺損，僅靠創面自身難以實現皮膚的再生,需要足夠的皮膚替代物進行修復。這時可以進行自體皮膚細胞的培養並應用於創面覆蓋。
培養的皮片在體外及移植於創面後均保持有正常表皮的自我更新能力,即保留了幹細胞自我更新與分化潛能的特性。培養的表皮除用於自體移植外，還用於異體移植,如應用於慢性潰瘍與Ⅱ度燒傷創面。直接利用皮膚幹細胞進行組織原位修復。
(2)在組織工程中的應用。人工真皮是利用組織工程技術形成商品化用於臨床的真皮替代物，它可誘發正常的皮膚癒合過程，已用於治療大面積燒傷病人的暫時性皮膚覆蓋及慢性皮膚潰瘍的治療。
(3)在基因治療中的應用。幹細胞因具有高度自我更新和多向分化潛能，因此一直為基因治療首選的靶細胞。將表皮幹細胞作為皮膚遺傳性疾病等基因治療的靶細胞已成為可能。將外源基因通過逆轉錄病毒導入表皮幹細胞並植入體內後，機體可長期維持轉導基因的表達，這就為表皮幹細胞應用於基因治療提供了可靠的依據。
基因治療除可用於皮膚遺傳性疾病治療外，對於各種原因引起的皮膚腫瘤等也同樣適用。如毛囊腫瘤，在了解其發生機制的基礎上，通過導入腫瘤抑制基因阻斷或抑制腫瘤發生過程，還可將耐藥基因或造血生長因子基因導入正常毛囊幹細胞或耐藥細胞株，提高化療耐受力。
轉變
介紹
美國斯坦福大學醫學院以轉化開創性醫學研究為病人提供優質護理而聞名。Dr. Zhiping(原分子和細胞生理學系博士後)和Dr. Ami Citri(精神病和行為學系博士後)結合他們的努力，與其他研究人員一道在Nature Protocols雜誌上發表了題為Induction of human neuronal cells by defined transcription factors, Nature; and also Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells的文章。這篇文章和其他的相關操作流程描述了他們如何將幹細胞和產後皮膚細胞轉變成神經(腦)細胞的工作。Dr Pang 說:"這些工作不僅在利用細胞模型研究人類神經疾病方面邁出了重要的一步，而且也將對解讀表觀遺傳學如何調控神經細胞的分化和成熟提供重要的參考。"
挑戰
作者在文中測試了兩種假設:1)確定強制性表達的轉錄因子是否可誘導人類多能幹細胞獲得神經元細胞特性，2)非神經元的人成纖維細胞是否也可被轉換成神經元。Citri博士說:"zhiping來找我，他需要這個項目能夠在單細胞水平上評估細胞群落中的多樣性。"他說:"要評估轉換成神經細胞的效率，成熟細胞的水平以及轉化後獲得特定的神經細胞的屬性都是理解從其他細胞誘導成神經元細胞的基礎。因此我們建立了一個流程，利用Fluidigm的動態整合微流體芯片來評估單個神經元。我們從一組相對大量的單細胞樣品中，檢測了一套膠質生物標記、神經元標記或成纖維細胞的標記物以評估神經元的轉換過程的效率和特異性。我們從小鼠神經元細胞開始，嘗試着檢測從Fluidigm公司平台獲得的數據的質量情況，但它的有效性立即讓我們吃了一驚。"
Dr Zhiping Pang在編寫這篇文章及本報告中提到的流程時是斯坦福大學醫學院分子和細胞生理學系博士後。他是新澤西州兒童健康研究所和羅伯特·伍德·約翰遜醫學院的神經科學和細胞生物學系助理教授。他的工作重點是研究肥胖症。
Dr Ami Citri博士是在斯坦福大學的精神病學和行為科學系做博士後的時候進的行這項研究。 2012年夏天，他將擔任耶路撒冷的希伯來大學的高級講師(助理教授)。他的工作重點是在成癮症的研究。
Dr Citri 認為:"Fluidigm的方法效力非常巨大，我幾乎不會再回頭去使用傳統的定量PCR方法了。"
解決方案
在他們的第一個實驗中，為了確定在人類多能幹細胞中表達轉錄因子是否可誘導神經元的屬性，在未分化的人類胚胎幹細胞(ES)中轉染了Brn2，ASCL1和myt1l(作者稱為"BAM")與增強型綠色熒光蛋白(EGFP)。經過處理後，他們觀察到雙極類神經細胞及成熟的神經元形態，並表達典型的神經元細胞TUBB3和MAP2蛋白。電生理分析顯示，這些細胞產生了動作電位。因此BAM因素可在人類幹細胞中誘導出神經細胞的的差異。在他們的第二個實驗中，他們想了解非神經元人成纖維細胞是否也可以被直接轉換成神經元。他們用BAM因素+ NEUROD1轉染初級人類胎兒成纖維細胞系(HFFs)。這些因素可產生成熟的神經元細胞，表達神經絲蛋白，及體現神經元的一些表徵過程，包括具有synapsin and synaptotagmin(兩個突觸囊泡蛋白)染色陽性。因此，BAM+NEUROD1因素可誘導非神經元人成纖維細胞的神經細胞分化。
方法
使用Fluidigm公司的48.48動態芯片進行單細胞基因表達分析。通過簇電極(patch electrodes)抽取收集生長在培養皿中的單細胞，並噴出到CellsDirect™緩衝液(Invitrogen)中，然後快速冷凍直到下一步工序。解凍的細胞進行特定目標的逆轉錄和18個循環的PCR進行預擴增(STA)。 預擴增產物在BioMark系統上進行實時PCR分析。為確保特異性的擴增，在每個實驗中包含梯度滴定的人腦總RNA，並只對表現出線性擴增的引物進行分析。此外，對單細胞和對照RNA的PCR產物熔解曲線進行比較，以確保PCR產物的特異性。BioMark系統為驗證免疫熒光和電生理的表型數據提供了另一層面的數據。這些研究人員在Nature protocols雜誌上發布了他們的實驗路程:Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells。Dr Pang說:"當人們談論以傳統的方式做單細胞PCR時，我從來沒有留下深刻的印象。這是低通量的，他們不能運行驗證測試。但有了Fluidigm公司的技術，我們可以使有多個內部對照，我們可以確定一個實驗是否能工作。該系統給了我們完美的結果。真正讓我感到驚訝的是，當我們重複了其中一個芯片的實驗，我們得到幾乎相同的結果，所以它是高度可重複的。我們認為，在神經科學界的其他人可能有興趣做這方面的工作。因此，我們寫了這個操作流程的文章並被雜誌接受。"
技術優勢
雖然這些研究人員主要使用的的BioMark系統進行神經元的研究，他們說，他們相信其他領域的研究也可以受益於這項技術。 "任何需要進行細胞群落在單細胞水平的多樣性的研究、及任何受起始原料限制的領域，這都將是富魯達技術發揮巨大效應的地方。"Citri博士說。"這可以是人的活組織切片檢查，或因為器官太小而從少量的組織中開始首次實驗，也可以是任何應用激光捕獲的顯微切割樣品，或提取的一個非常明確的細胞群體。"
Dr Pang說:"單細胞基因表達分析適用於許多領域，包括細胞生物學和神經學。當有異質性的細胞群，細胞特異性基因轉錄的識別就變得非常重要。"在這個研究之後，這兩個科學家已經接受了在各自新的研究機構的學術職位，但他們都打算繼續使用富魯達的平台進行單細胞的研究。
"Fluidigm的方法效力是如此的巨大，我幾乎不會再回頭去使用傳統標準的定量PCR方法。"Dr. Citri說。"這是非常有用的，因為它讓我用高效率和低成本的方式驗證微芯片(microarray)數據。當我在各種應用中檢測大量的基因時，我不需要每次用微芯片來處理樣品。我可以用富魯達公司的微流體芯片用數百個探針研究很多樣本。從原始的微芯片實驗中我已經創建了一個候選基因和定量PCR探針數據庫。此外，有效地利用最小的樣品量，可以讓我把我的樣品作成一個文庫，每當一組新的基因成為我的興趣焦點時我可以不斷對他們進行檢測。對我來說，這是Fluidigm公司系統的巨大優勢之一。"
Dr Pang在2011年11月開始在新澤西州兒童健康研究所和羅伯特·伍德·約翰遜醫學院的神經科學和細胞生物學系擔任助理教授進行獨立科研工作。
"我實驗室的研究重點是:研究從幹細胞到大腦的突觸調節機制。我有興趣了解肥胖人的食物攝入行為是如何被身體的激素和神經肽改變的。"他說， "一個有趣的現象是，在下丘腦區域有一組神經元表達瘦素(leptin)受體，但它們對瘦素的反應有很大差異。我推斷下丘腦不同的細胞有不同的基因表達模式，這些只能用單細胞基因表達譜來解析。我的另一個研究方向是用人的成纖維細胞或多能性幹細胞誘導成神經細胞，用這作為細胞模型來研究人類神經系統疾病。單細胞的基因分析將是在我的實驗室中研究這些突觸調控會使用的主要技術之一。"