基因扩增

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基因扩增就是基因拷贝数增加或表达活性增强。gene amplification 为一特异蛋白质编码的基因的拷贝数选择性地增加而其他基因并未按比例增加的过程。在自然条件下，基因扩增是通过从染色体切除基因的重复序列再在质粒中进行染色体外复制或通过将核糖体RNA的全部重复序列生成RNA转录物再转录生成原来DNA分子的额外拷贝而实现的。在实验室已建立了不等交换、从裂解细胞提取DNA或经过滚环复制生成染色体外序列进行人工基因扩增。例如在爪蟾卵子发生时，编码rRNA的基因数增加约4000倍。

目录

概述

临床基因扩增实验又称PCR实验，是专门用来检验艾滋病、 乙型肝炎、禽疫病等病毒 感染性疾病的一种检测手段。它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法，测出一些病毒含量不高的 感染者体内是否含有特定的病毒。由于该检测方法可以测出普通检验难以检测出的病毒并具有 灵敏度高、 特异性高、快捷、对 样品要求低等优点，因此被临床医生广为认可，已广泛应用于医院的临床诊断和各防疫检测部门的禽疫病诊断。但是，这种实验需要有能保证绝对安全、配置合理的实验室和非常规范的操作为前提。近年来对临床基因扩增检验实验室的建设越来越得到重视，因为它对检测结果的可靠性、准确性和安全性起到至关重要的作用。本文主要从临床基因扩增检验实验室的平面布局， 空调通风系统设计、 气流控制和 污染的防制几个方面对实验室设计中的主要特点进行了阐述。临床基因扩增检验实验室设计的核心问题是如何避免污染。因此，实验室的平面布局、空调通风系统设计、气流控制等都是围绕这个核心问题进行的。下面就对这几个方面分别进说明。

细胞内选择性复制DNA,产生大量的拷贝。如 两栖类 卵母细胞在发育的早期，rRNA基因的数量扩增到1000多倍。基因扩增是通过形成几千个核进行的，每个核里含有几百拷贝的编码28S、18S和5.8S的rRNA基因，最后卵母细胞中的这些rRNA基因的拷贝数几乎达到50万个，而在相同 生物的其它类型细胞中，这些rRNA基因的拷贝数只有几百个。卵母细胞中有如此众多的rRNA基因拷贝，为 卵细胞在受精后的发育过程中合成大量 核糖体创造了条件。

至于卵母细胞中rRNA基因扩增的机制，有人认为可能是通过从染色体上分离出来的环状DNA分子，这种环状DNA中含有rRNA基因，但是第一个含有rRNA基因的环状DNA是如何形成的尚不清楚。由于环状DNA能够通过滚环复制(rollingcirclereplication)的方式进行复制，因而能够产生大量的rRNA基因。 为一特异蛋白质编码的基因的拷贝数选择性地增加而其他基因并未按比例增加的过程。在自然条件下，基因扩增是通过从染色体切除基因的重复序列再在质粒中进行染色体外复制或通过将核糖体RNA的全部重复序列生成RNA转录物再转录生成原来DNA分子的额外拷贝而实现的。在实验室已建立了不等交换、从裂解细胞提取DNA或经过滚环复制（rollingcirclereplication）生成染色体外序列进行人工基因扩增。例如，在 非洲爪蟾的卵母细胞中原有rRNA基因（rDNA）约200个拷贝，在 减数分裂Ⅰ的 粗线期，这个基因开始迅速复制，到 双线期它的拷贝数约为200万个，扩增近4000倍，可用于合成10的12次方个核糖体，以满足 卵裂期和胚胎期合成大量蛋白质的需要。在 果蝇中也发现了基因扩增现象。在卵巢成熟之前，卵巢颗粒细胞中产生卵壳蛋白的基因被扩增。果蝇中的 卵原细胞，经4次分裂产生16个细胞，其中一个是卵母细胞（oocyte），将发育成为卵细胞，其他15个是 营养细胞（nursecell），它们为卵细胞的形成提供大量的蛋白质及其他 大分子物质，营养细胞之所以能够产生大量的营养物质，是因为它们在形成的过程中发生了多次特殊的DNA复制 ，卵壳蛋白等基因拷贝数显著增加。

PCR实验室平面布局

临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域： 试剂贮存和准备区、 标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区、扩增产物分析区。为避免 交叉污染，进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。各实验区之间的试剂及样品传递应通过 传递窗进行。 实验室空调通风系统设计及压力控制

PCR实验室并没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性，宜采用全送全排的 气流组织形式。同时，要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。

1试剂贮存和准备区 该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和 主反应 混合液的制备。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。对与气流压力的控制，本区并没有严格的要求。

2标本制备区 该区域主要进行的操作为临床标本的保存、 核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。本区的 压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的 气溶胶污染。另外，由于在加样操作中可能会发生 气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。

3扩增反应混合物配制和扩增区 该区域主要进行的操作为DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在 巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在 超净台内进行。

4扩增产物分析区 该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。如使用全自动封闭 分析仪器检测，此区域可不设。本区是最主要的扩增产物污染来源，因此对本区的压力梯度的要求为：相对于邻近区域为负压，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。 污染的预防与控制

PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。在实际工作中，常见的有以下几种污染类型：扩增产物的污染；天然基因组DNA的污染；试剂的污染以及标本间的污染。由于一旦发生污染，实验就必须停止，直到找到污染源为止，而且实验结果必须作废，需重新进行实验。所以发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时而且繁琐，浪费人力物力。因此要避免污染，首先应是预防，而不是排除。

工作区域的严格划分

1.（1）各个实验区域设置合理； （2）各个实验区域要有明显的标记（如醒目的 门牌或不同的地面颜色等），以避免各个不同实验区域设备物品、试剂等发生混淆。

2合理的系统设置 （1）合理的空调通风系统设置，尽量采用全送全排的空调系统； （2）严格的气流压力控制，保证不同的实验区内不同的压力要求。

3规范的操作 （1）临床基因扩增检验实验室的技术人员必须进行上岗培训，经培训合格后才能从事临床基因扩增检验的工作； （2）在实验操作过程中，操作者必须戴 手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施； （3）清洁工作及时、正确。实验工作结束后，必须立即对本区进行清洁。除常规的 消毒液体对表面进行擦拭 消毒或 紫外线灯的照射消毒外，对一些 实验设备还应进行高压消毒处理。

4严格的管理 （1）严格控制进出实验室的人员。与实验无关的人员不得随意进出实验室，有条件的情况下要设置独立的通道和进出整个实验区的门； （2）在各个实验区域使用带有明显区别标志的工作服（如不同颜色），当工作人员离开时不得将本区的工作服带至其它区域； （3）尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性。 （4）扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源，废液不能在实验室中倾倒，必须经消毒液浸泡消毒后在远离实验室的地方弃掉，用过的吸头等一次性材料也应经消毒液浸泡消毒后统一处理，如焚烧等； （5）扩增产物分析区可能会用到某些可致 基因突变和 有毒物质，应特别注意实验人员的安全防护。

5完备的实验室配套设施 完备的实验室配套设施是保证实验工作的必要条件，应根据各个 实验室实验内容的不同配备相应的设备和仪器，如 超净工作台、 离心机、加样器等。

实验原理

多聚酶 链式反应的原理类似于DNA的天然 复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡 核苷酸 引物，经 变性、退火和延伸若干个 循环后，DNA扩增2n倍。 1．变性：加热使模板DNA在 高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。 2．退火：使溶液温度降至50－60℃，模板DNA与引物按 碱基配对原则互补结合，即退火阶段。 3．延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA 聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧 核苷三磷酸（dNTP)，按5’→3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。 上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应 缓冲液、dNTP、两个合成的DNA引物、耐热Tag聚合酶。

实验仪器

1.PCR热循环仪 2. 移液器（0.1-2.5μL）3.PCR板

实验 试剂

1．10×缓冲液：500mmol/LKCI、100mmol/LTriS·HCI(pH8.3，室温）、15mmol/LMgCl2

2.dNTPMix：2.5mmol/LdATP、2.5mmol/LdCTP、2.5mmol/LdGTP、2.5mmol/LdTTP

3.Tag酶5U/μL：

4.DNA模板1ng／μL：

5.引物1

6.引物2

7.引物溶液 浓度2uM

实验步骤

1．在200ulEppendorf管内配制20ul反应体系

2．按下述程序进行扩增 94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min30s30cycle；72℃延伸4min；4℃ pause

注意事项

1． 引物设计应具有 特异性，依靠引物设计软件进行引物设计；引物分装成多管，不宜反复冻融多次；

2．PCR反应的各种成份不能遗漏，操作应戴 手套，冰上操作；

3．根据引物的 Tm值和扩增片段长度以及 PCR仪的特性来设定PCR循环条件；

4．注意分析 电泳检测PCR产物时出现拖带或非特异性扩增带、无DNA带或DNA带很弱的可能原因。

　　智能型基因扩增PCR装置在京研制成功 以 聚合酶链式反应(PCR)为基础的 离体 基因扩增技术对 基因工程的研究和应用产生了革命性影响。提供自动化的PCR专用仪器则是推广 PCR技术的关键。为解决国产PCR装置的更新换代并替代大量进口，中科院 发育生物学所最近完成了以智能化 仪表控制系统为核心的干式基因扩增PCR装置，经多种对照引物和模板DNA的PCR实验，获完全成功，即将通过技术鉴定并批量生产。该仪器的研制成功为 分子生物学、生物工程、医学和 法医学鉴定及 考古、环卫等研究和应用部门掌握和应用PCR技术提供了高性能价格比的新装备。该PCR装置采用 人机对话操作方式，利用单片机小型 专家系统，以丰富的智能化软件取代了常规仪器的大部分硬件功能，使整机结构大大简化，操作方便.工作可靠，性能精良。其别具特色的实时动态运行状态显示、自动整定最佳PID参数、 传感器偏差补偿、九组九步任意曲线串接编程、确保曲线平台和伺服起动、多种可预设上电方式、 掉电保护及报警等硬件软化功能充分显示了智能化仪表技术的优越性。为已有的国内外PCR装置。 HBVC区基因扩增与PCR条件的优化

目的：为提高PCR检测 乙型肝炎病毒(HBV)的特异性和灵敏度，降低成本，对PCR条件进行优化。方法：将HBV特异性基因片段转化到 大肠杆菌DH5α中，提取 质粒，利用 PCR扩增HBVC区基因，对PCR条件中的 退火温度、 Mg2+浓度进行优化，并比较3种不同TaqDNA聚合酶的灵敏度。结果：HBVC区基因扩增的最佳退火温度为58℃,最佳Mg2+浓度为1.5mmol/L，BiostarTaqDNA聚合酶扩增到10-6。讨论：对HBVC区基因进行了转化和PCR实验条件的优化，为扩大PCR在乙型肝炎病毒(HBV)检测领域中的应用提供实验依据。