纖維素酶
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中文名稱 ：纖維素酶 種類介紹 ：組成與功能、機理等 發酵工藝 ：固體發酵和液體發酵 外文名稱 ：Cellulase |
纖維素酶，是由多種水解酶組成的一個複雜酶系，自然界中很多真菌都能分泌纖維素酶。習慣上，將纖維素酶分成三類：C1酶、Cx酶和β葡糖苷酶。C1酶是對纖維素最初起作用的酶，破壞纖維素鏈的結晶結構。Cx酶是作用於經C1酶活化的纖維素、分解β-1，4-糖苷鍵的纖維素酶。β葡糖苷酶可以將纖維二糖、纖維三糖及其他低分子纖維糊精分解為葡萄糖。[1]
目錄
基本資料
纖維素酶(英文:cellulase)是酶的一種，在分解纖維素時起生物催化作用。是可以將纖維素分解成寡糖或單糖的蛋白質。纖維素酶廣泛存在於自然界的生物體中。細菌、真菌、動物體內等都能產生纖維素酶。一般用於生產的纖維素酶來自於真菌，比較典型的有木霉屬(Trichoderma)、麴黴屬(Aspergillus)和青黴屬(Penicillium)。產生纖維素酶的菌種容易退化，導致產酶能力降低。細菌產纖維素酶的產量較少，主要是葡聚糖內切酶，大多數對結晶纖維素無降解活性，且所產生的酶多是胞內酶或吸附在細胞壁上，不分泌到培養液中，增加了提取純化的難度，因此對細菌的研究較少。但由細菌所產生的纖維素酶一般最適pH 為中性至偏鹼性。近20年來,隨着中性纖維素酶和鹼性纖維素酶在棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業中的成功應用,細菌纖維素酶製劑已顯示出良好的應用前景。纖維素酶在食品行業和環境行業均有廣泛應用。在進行酒精發酵時，纖維素酶的添加可以增加原料的利用率，並對酒質有所提升。由於纖維素酶難以提純，實際應用時一般還含有半纖維素酶和其他相關的酶，如澱粉酶(amylase)、蛋白酶(Protease)等。纖維素酶種類繁多，來源很廣。不同來源的纖維素酶其結構和功能相差很大。由於真菌纖維素酶產量高、活性大，故在畜牧業和飼料工業中應用的纖維素酶主要是真菌纖維素酶。
分類
按組成與功能
纖維素酶根據其催化反應功能的不同可分為內切葡聚糖酶(1,4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4)，來自真菌的簡稱EG，來自細菌的簡稱Cen、外切葡聚糖酶(1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91)，來自真菌的簡稱CBH，來自細菌的簡稱Cex) 和β-葡聚糖苷酶(β-1,4- glucosidase，EC.3.2.1.21)簡稱BG。內切葡聚糖酶隨機切割纖維素多糖鏈內部的無定型區，產生不同長度的寡糖和新鏈的末端。外切葡聚糖酶作用於這些還原性和非還原性的纖維素多糖鏈的末端，釋放葡萄糖或纖維二糖。β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖產生兩分子的葡萄糖。真菌纖維素酶產量高、活性大，在畜牧業和飼料工作中主要應用真菌來源的纖維素酶。
按降解機理
纖維素酶反應和一般酶反應不一樣，其最主要的區別在於纖維素酶是多組分酶系，且底物結構極其複雜。由於底物的水不溶性，纖維素酶的吸附作用代替了酶與底物形成的ES複合物過程。纖維素酶先特異性地吸附在底物纖維素上，然後在幾種組分的協同作用下將纖維素分解成葡萄糖。1950年，Reese等提出了C1-Cx假說，該假說認為必須以不同的酶協同作用，才能將纖維素徹底的水解為葡萄糖。協同作用一般認為是(C1酶)首先進攻纖維素的非結晶區，形成Cx所需的新的游離末端，然後由CX酶從多糖鏈的還原端或非還原端切下纖維二糖單位，最後由β-葡聚糖苷酶將纖維二糖水解成二個葡萄糖。不過，纖維素酶的協同作用順序不是絕對的，隨後的研究中發現，C1-Cx和β-葡聚糖苷酶必須同時存在才能水解天然纖維素。若先用C1酶作用結晶纖維素，然後除掉C1酶，再加入Cx酶，如此順序作用卻不能將結晶纖維素水解。
影響因素
纖維素酶的最適pH一般在4.5~6.5。葡萄糖酸內酯能有效的抑制纖維素酶，重金屬離子如銅和汞離子，也能抑制纖維素酶，但是半胱氨酸能消除它們的抑制作用，甚至進一步激活纖維素酶。植物組織中含有天然的纖維素酶抑制劑;它能保護植物免遭黴菌的腐爛作用，這些抑制劑是酚類化合物。如果植物組織中存在着高的氧化酶活力，那麼它能將酚類化合物氧化成醌類化合物，後者能抑制纖維素酶。
菌種選育
菌種選育是纖維素酶生產的基礎性工作，國內外許多專家進行了大量研究，為了生產高質量的纖維素酶產品，王家林等(1996)在吸收國內外經驗的基礎上，先後引進了綠色木霉木10、綠色木霉Sn-91014、康氏木霉NT-15、黑麴黴XX-15A，在此基礎上，採用了紫外線、特定電磁波輻射、線性加速器，亞硝基胍等物理、化學的誘變方法，獲得了高產菌株NT15-H、NT15-H1、XT-15H、XT-15H1。其中木霉NT-15H固體培養活力經輕工部食品質量監督檢測中心南京站檢測表明，濾紙活力為3670u/g, C1-酶活力24460u/g，Cx-酶活力1800u/g，已達到國際先進水平。此菌種在工廠化生產中性能穩定。張苓花等(1998)採用康氏木霉W-925，J-931，經過濃度為2%硫酸二乙酯和紫外線(15W、30cm、2min)複合誘變後，得到了產酶活性高的Wu-932菌種，該菌種CMC糖化力達到2975，濾紙糖酶活性為531，比出發菌W-925分別提高了100%和81%。化工部飼料添加劑技術服務中心王成書等(1997)採用該中心的里氏木霉A3先進行紫外線和亞硝基胍複合誘變後，將處理過的孢子接種於纖維雙層平板上，30℃培養5-8天，15℃放置7-10天，挑選透明圈直徑和菌落直徑比較大的單菌落進行三角瓶固態發酵再篩選，得到了產纖維素酶活力很高的里氏木霉91-3菌株。纖維素酶菌種易退化，退化後其產酶力明顯降低，其原因可能有三個方面:
- ①經誘變篩選的菌種發生回復突變。
- ②自然負突變。
- ③菌種長時間低溫斜面保藏，會在分生孢子上長出次生菌絲，而次生菌絲所形成的分生孢子生命力弱，這可能是菌種退化的主要原因。為了避免纖維素酶菌種退化，張苓花等(1998)報道，採用砂土管保藏菌種。即將過篩洗淨的砂子與土以3:2比例混合分裝在試管內，用1kg/cm2壓力滅菌30分鐘共三次，將欲保存的斜面菌種製備成1000ml孢子懸浮液，每個砂土管注入0.5ml，搖勻，放入盛有無水CaCl2真空乾燥器內保存。經測定，在所測的121天內，酶的活性基本不變;酶活性下降50%的時間，由常規方法的60天延長至160天，明顯地減緩了菌種退化速度。
發酵工藝
纖維素酶的生產工藝主要有兩種，即固體發酵和液體發酵，其工藝如下:影響產酶量和活力的因素影響纖維素酶產量和活力的因素很多，除菌種外，還有培養溫度、pH、水分、基質、培養時間等。這些因素不是孤立的，而是相互聯繫的。張中良等(1997)採用均勻設計Cl12(1210)，以綠色木霉(T.ViriclePers.expr)為菌種，研究了影響產纖維素酶的五大因素對產酶量和活力的作用，認為基質粗纖維含量為40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31℃條件下培養45h可獲得最大產酶量26mg/g和CMC酶活力20mg/g·h。王成華等(1997)也研究了其誘變篩選的里氏木霉91-3的產酶條件，結果表明該菌種以7:3的秸稈粉和麥麩，另添加4%硫酸銨、0.4%磷酸二氫鉀、0.1%硫酸鎂為最佳培養基，28-32℃為適宜培養溫度，30℃為最佳溫度，4%為最佳接種量，96h到達發酵高峰。張苓花等(1998)研究了以康氏木霉W-925為出發菌，經誘變後得到的Wu-932纖維素酶高產菌的最佳發酵條件。結果表明，以1:2的麥麩和稻草粉為培養基，5%的接種量，稻草粉碎平均長度3-5mm，初始pH4-5，溫度在28-35℃，發酵時間72h為最佳發酵條件。
污染菌的控制
飼用纖維素酶普遍存在一種俗稱的"白毛菌"污染。污染後輕者酶活性下降，重者發酵失敗。為此，研究控制發酵污染意義很大。張苓花等(1998)研究"白毛菌"的菌落特徵、來源、生長和生理特徵及控制方法，找到了一種與康氏木霉Wu-932呈共生關係，而與"白毛菌"呈競爭性抑制關係的熱帶假絲酵母菌J-931。利用此菌進行混合發酵，可有效地控制"白毛菌"的污染。
農業應用
纖維素酶在畜禽生產中的應用:常見的畜禽飼料如穀物、豆類、麥類及加工副產品等都含有大量的纖維素。除了反芻動物藉助瘤胃微生物可以利用一部分外，其它動物如豬、雞等單胃動物則不能利用纖維素。以下是纖維素酶在牛、雞、豬日糧中的應用:
牛的日糧
焦平林等(1996)用閹牛試驗，在日糧中按每頭每日添加纖維素酶40g，飼餵60天，結果表明加酶組日增重892.78g，對照組日增重746.8g，差異極顯著(P<0.01)。焦平林又用30頭荷斯坦奶牛進行試驗，試驗組按每頭每日添加50g纖維素酶，結果表明，試驗組15頭奶牛在68天總產奶量為2916kg,而對照組15頭奶牛在68天的總產奶量為2689kg，差異顯著(P<0.05)。付連勝等(1998)報道，在瘤胃功能正常狀態下，成年奶牛及育成牛飼餵纖維素酶5天後，其糞便乾物質和飼餵前相比，減少30%，一周後，封閉式牛舍氨含量下降70%左右，粗飼料採食量提高8-10%，尿中尿素下降58.9%，懷孕奶牛在產前30天始飼餵纖維素酶，分娩後，不產生生理性消化不良症狀，胎兒體重可增加1.5-3kg，並無畸形和弱胎。產牛體質恢復快，產奶高峰維持時間長(一直至第四個泌乳月)。趙長友等(1998)綜述了纖維素酶在草食動物日糧中的應用，均取得了顯著效果。
雞的日糧
肉雞日糧一般以高魚粉、高玉米、高豆粕為主。為減少這些常規原料的使用量，廣泛採用廉價的飼料原料，秦江帆等(1996)在肉雞日糧中提高富含纖維的麥麩比例，添加0、0.05%、0.1%纖維素酶製劑進行試驗，結果表明，添加0.1%纖維素酶組比對照組在1-2、3-6、7-8周三個生長階段日增重分別提高4.31%、4.54%、4.13%，耗料比分別下降1.56%、4.50%、4.3%。徐奇友(1998)在蛋雞日糧中添加0.1%、0.15%、0.5%纖維素酶，結果表明，在1-10月的產蛋期間，產蛋率分別提高0.53%、1.25%、2.88%，酶水平0.15%和0.5%組的破蛋率降低34.49%、16.19%，蛋殼強度分別提高14.71%和8.41%。
豬日糧
據尹清強等(1992)報道，在基礎日糧中添加0.6%和1.2%纖維素複合酶，結果生長育肥豬增重比對照組分別提高16.84%和21.86%。Wank等(1993)報道，添加纖維素酶，使中性洗滌纖維消化率由30.3%提高到34.1%，酸性洗滌纖維消化率從68.8%提高到73.9%，能量消化率由69.3%提高到71.8%。
展望
我國是一個飼料資源十分緊張的國家，土地少、人口多，人畜爭糧的矛盾十分突出。要保持我國飼料工業和畜牧業的持續發展，必須解決好飼料問題，否則將嚴重製約其發展。纖維素是自然界中十分豐富的資源，是800-1200個葡萄糖分子聚合而成。因此，可通過微生物發酵充分利用農副產品下腳料、秸稈、糠生產纖維素酶添加劑，用於提高畜禽生產性能，提高飼料利用率，改善飼料的營養價值，降低飼料成本和提高經濟效益，具有廣闊的開發前景，今後應進一步加強纖維素酶研究和開發工作。主要有如下幾方面: 進一步加強作用機制研究纖維素酶應用於飼料，作用於動物消化道，其機制尚未清楚。從理論上決定其添加量還很困難，受影響因素很多，往往效果不夠理想。對於單用多種原料的纖維素酶最佳添加量也研究不多，這將嚴重製約纖維素酶的推廣應用。成本偏高，今後應加強菌種選育和發酵工藝等基礎研究工作，以提高其產量和活性，特別是要注意利用DNA基因重組技術的應用，來選育出活性高、產酶量大的菌種。
需加強檢測方法研究
雖然纖維素酶的檢測方法很多，但真正能適合飼料的檢測方法還沒有，這給實際應用工作帶來困難，如無法比較不同廠家的產品質量，確定纖維素酶添加量也很困難，應組織有關力量，制訂出統一的檢測方法標準，供生產中應用。[2]
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