聚合酶鏈式反應

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聚合酶鏈式反應是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA複製，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛髮、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是「微量證據」的威力之所在。由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味着PCR技術的真正誕生。到如今2013年，PCR已發展到第三代技術。1973 年，中國台灣科學家錢嘉韻，發現了穩定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。

目錄

PCR原理

DNA的半保留複製是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據鹼基互補配對原則複製成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外複製。

但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。

耐熱DNA聚合酶--Taq酶的發現對於PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，並逐步應用於臨床。

PCR技術的基本原理類似於DNA的天然複製過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留複製鏈，重複循環變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的「半保留複製鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

PCR的創建

Khorana (1971)等最早提出核酸體外擴增的設想：「經DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，並不斷重複該過程便可合成tRNA基因。」

但由於當時基因序列分析方法尚未成熟，熱穩定DNA聚合酶尚未報道以及引物合成的困難，這種想法似乎沒有實際意義。加上70年代初分子克隆技術的出現提供了一種克隆和擴增基因的途徑，所以，Khorana的設想被人們遺忘了。

1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期間，發明了PCR。Mullis要合成DNA引物來進行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。

1983年4月的一個星期五晚上，他開車去鄉下別墅的路上,猛然閃現出「多聚酶鏈式反應」的想法。

1983年12月，Mullis用同位素標記法看到了10個循環後的49 bp長度的第一個PCR片段；

1985年10月25日申請了PCR的專利，1987年7月28日批准（專利號4,683,202 ），Mullis是第一發明人；

1985年12月20日在Science雜誌上發表了第一篇PCR的學術論文，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港實驗室做專題報告，全世界從此開始學習PCR的方法。

循環參數

預變性 （Initial denaturation）

模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對PCR能否成功至關重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。

變性步驟 循環中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時間

變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。

引物退火 （Primer annealing）

退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的Tm值為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。

退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

引物延伸 引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略

延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。

循環數 大多數PCR含25-35循環，過多易產生非特異擴增。

最後延伸 在最後一個循環後，反應在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸完全，並使單鏈產物退火成雙鏈。

步驟

標準的PCR過程分為三步：

DNA變性 （90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

退火 （60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

延伸 （70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示：現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內複製完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。

檢測 PCR反應擴增出了高的拷貝數，下一步檢測就成了關鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。

反應特點

特異性強 PCR反應的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結合；

②鹼基配對原則；

③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；

④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循鹼基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合（復性）可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。

靈敏度高 PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（μg=-6）水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位）；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。

簡便快速 PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好後，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗製品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛髮、細胞、活組織等DNA擴增檢測。

儀器

pcr儀器的發展pcr溫度循環至關重要，pcr擴增儀各參數必須準確。自perkin –elmercetus公司第一台pcr擴增儀問世以來，現已有幾十家不同的廠家在國內外生產和銷售pcr擴增儀。在短短的幾年間，擴增儀經過幾代的發展，不斷採用新技術，並且進一步朝方便、實用、高智能化和自動化的方向發展。

為了便於了解和選購適宜的pcr實驗設備，現將部分國內外pcr擴增儀列表如下；這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達到熱循環的目的，各有其優缺點。國產1109型dna擴增儀則是用恆溫浴機械手移位式。更接近於手工操作。ptc-51a/b體積小，智能化與自動化程序高，可以兼做套式pcr，方便實用。以上各種儀器一般都配有微電腦自動控制溫度、時間及循環數，可以達到節省勞動力的目的。在採用這些儀器作pcr試驗之前，一般均應實測管內溫度變化循環情況，以了解升、降溫時管內因熱傳導造成的溫度滯後情況和實際到達的最高、最低溫度，用於修正設計的循環參數。溫度滯後受到所用eppendorf管材料、壁厚及形狀（與鋁塊孔匹配程度）的影響，這對變溫鋁塊式儀器影響更大些。對於配用制冷機式半導體元件致冷的儀器，在使用低於室溫的溫度來保冷pcr反應後小管時，應注意冷凝水的問題，勿使流入儀器內浸濕半導體元件而損壞儀器。

國內dna擴增儀 ：1109型，90a/b型，ptc-51a/b型

1109型

北京新技術所與軍科院聯合

機械臂

變溫水浴

電子調溫

40×0.5ml

16400元/台

90a/b型

中科院遺傳所

機械臂

變溫水浴

電熱

14000元/台

ptc-51a/b型

軍事醫學科學院

變溫氣流

電子調兼作套式

30×0.5ml

12000元/台

國外dna擴增儀 ：dna thermal cycler perkin –elmercetus（美），thermocycler b..braun biotech(德)，automatic temperature cy-cler single block twin block ericomp inc.（美） ，grant autogen grant instrumant ltd（美） ，techne phc-1/phc-2 techne ltd.（英） ，biooven biothrm corp（美） ，trio-thermo-block tb-1biomertra（德），micro cycler e eppendorf（美） 變溫鋁塊

dna thermal cycler perkin –elmercetus（美）

變溫鋁塊

壓縮機致冷

48×0.5ml

us $ 20000.-

thermocycler b..braun biotech(德)

變溫水浴98℃四檔

電熱，自來水冷卻

60×1.5ml

100×1.5ml

180×1.5ml

dm 30000.-

automatic temperature cy-cler single block twin block ericomp inc.（美）

變溫鋁塊25～100℃

電熱，自來水冷卻

29×1.5ml

58×1.5ml

us $4985.-

us $7980.-

grant autogen grant instrumant ltd（美）

變溫水浴0～99℃

電熱，自來水冷卻或加冷循環器

50×1.5ml

or

50×1.5ml

us $250. –plus

us $ 15.-for

rack(x2)

techne phc-1（phc-2）techne ltd.（英）

變溫鋁塊0～99℃三檔

電熱500w水冷100w

54×0.5ml

54×0.5ml

24×1.5ml

￡3383. –

￡3997. -

biooven biothrm corp（美）

變溫氣流

-150℃

115v 11a

200’s of 4×96plate

us $ 2990. -

trio-thermo-block tb-1biomertra（德）

半導體變溫

220v

3×20管

分別控溫

dm12900. -

micro cycler e eppendorf（美） 變溫鋁塊

220v/100v

3×29管

us $ 3500. -

常見問題

PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些最好於當日電泳檢測，大於48h後帶型不規則甚至消失。

假陰性 不出現擴增條帶。

PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的製備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及溴乙錠的使用， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除淨，特別是染色體中的組蛋白，④在提取製備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配製有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。

陰性 需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變：通常進行PCR擴增採用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 後，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

假陽性 出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補後，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現非特異性擴增帶

PCR擴增後出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。適當提高退火溫度或採用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

出現片狀拖帶或塗抹帶

PCR擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由於酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環次數。

克隆PCR產物

1）克隆PCR產物的最優條件是什麼？

最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值範圍。連接用5ul 2X連接液，50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求，為提高連接效率，需4℃過夜。

2)PCR產物是否需要用凝膠純化？

如凝膠分析擴增產物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

3）如果沒有回收到目的片段，還需要作什麼對照實驗？

A）塗布未轉化的感受態細胞。

如有菌落，表明氨苄失效，或污染上帶有氨苄抗型的質粒，或產生氨苄抗型的菌落。

B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。

例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋，1ul用於100ul感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul後，用100ul鋪板。培養過夜，產生1000個菌落。轉化率為：產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。

鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u後含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：

1000克隆X103ng /鋪板1 ng DNA ug=106cfu/ ug

轉化pGEM-T應用108cfu/ ug感受態細胞

如沒有菌落或少有菌落，感受態細胞的轉化率太低。

C）如用pGEM-T正對照，或PCR產物，產生>20-40藍斑（用指定步驟108cfu/ug感受態細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質量標準好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。

D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態細胞（108cfu/ug），按照指定的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應為白斑，如產生>20-40藍斑，沒有菌落或少有菌落，連接有問題。

4）對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什麼問題？

A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數克隆，為提高效率，需4℃過夜。

B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新製備。如產生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。

C）插入片段不適於連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發生。UV過度照射會產生嘧啶二聚體，不利於連接，DNA必需重新純化。

D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A，後者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）。

E）高度重複序列可能會不穩定，在擴增中產生缺失和重排，如發現插入片段高頻率地產生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞

PCR反應體系與反應條件

標準的PCR反應體系：

10×擴增緩衝液 10ul

4種dNTP混合物 各200umol/L

引物 各10～100pmol

模板DNA 0.1～2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+　1．5mmol/L

加雙或三蒸水至 100ul

PCR反應五要素：參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決於引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

原則 ①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物鹼基：參照引物設計的基本原則

④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，以避免因末端鹼基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U（指總反應體積為100ul時），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

dNTP的質量與濃度

dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關係，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度後，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩衝液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配製），如其中任何一種濃度不同於其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。

模板（靶基因）核酸　模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常採用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，並解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質結合而沉澱；蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉澱核酸。提取的核酸即可作為模板用於PCR反應。一般臨床檢測標本，可採用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用於PCR擴增。RNA模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+濃度　Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。

反應條件選擇 PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。

溫度與時間的設置：基於PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中採用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火併結合到靶序列上，然後快速升溫至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對於較短靶基因（長度為100～300bp時）可採用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般採用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。

①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低於93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。

②退火（復性）溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性後溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由於模板DNA比引物複雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對於20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值（解鏈溫度）=4(G+C)+2(A+T)

復性溫度=Tm值-(5～10℃）

在Tm值允許範圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高於90℃時， DNA合成幾乎不能進行。

PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利於引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。

實驗室布局 PCR實驗室按規定需要四間，分別是1 試劑儲存和準備區、2 標本製備區、3擴增反應混合物配製和擴增區、4擴增產物分析區，布局見圖1。圖1 四間PCR實驗室區域設置

如果使用全自動分析儀，各區域可適當合併，我們建議將擴增區和產物分析區合併為擴增檢測區即共三個間，

圖2 三間PCR實驗室區域設置

按國家衛生部的要求，進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向順序，即只能從試劑儲存和準備區?標本製備區擴增反應混合物配製和擴增區?擴增產物分析區，避免發生交叉污染。各工作區必須安裝適當的排風設備確保空氣流向按單一方向。工作區的牆面、地面、辦公用品等必須選用耐消毒藥品腐蝕的材料。工作區必須有明確的標記，避免不同工作區域內的設備、物品混用。

設置標準 各工作區域必須配備排風扇、空調、耐腐蝕地面和工作檯面、更衣櫃、鞋櫃、專用辦公用品、專用工作服和工作鞋、移動紫外燈等，保證安全衛生需要。

根據國家衛生部《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》，各工作區域必備儀器設備如下：

一 試劑儲存和準備區

1．2-8℃和-15℃冰箱

2．混勻器

3．微量加樣器（覆蓋1-1000μl）

4．移動紫外燈（近工作檯面）

5．消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）

6．專用工作服和工作鞋

7．專用辦公用品

二標本製備區

1．2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱

2．高速台式冷凍離心機

3．混允器

4．水浴箱或加熱模塊

5．微量加樣器（覆蓋1-1000μl）

6．可移動紫外燈（近工作檯面）

7．超淨工作檯

8．消耗品：與「試劑儲存與準備區」的消耗品相同

9．專用工作服和工作鞋

10．專用辦公用品

如需處理大分子DNA，應具有超聲波水浴儀。

三基因擴增區和產物分析區

1． 全自動定量核酸擴增儀（含計算機、打印機）

2． 微量加樣器（覆蓋1-1000μl）

3． 可移動紫外燈（近工作檯面）

4． 消耗品：與「試劑儲存與準備區」的消耗品相同

5． 專用工作服和工作鞋

6． 專用辦公用品

各工作區域必須有明確的標記，避免不同工作區域內的設備、物品混用。在不同的工作區域應使用不同顏色或有明顯區別標誌的工作服，以便於鑑別。當工作者離開工作區時，不得將各區特定的工作服帶出。

3．實驗室質量管理

PCR實驗室內工作人員必須參加由國家衛生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴增培訓班，並持證上崗。PCR實驗室通過驗收，實驗室至少必須應有兩個以上持有「臨床基因檢測上崗證」。PCR實驗室必須建立嚴格的實驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛生部的要求，確保檢測結果準確、確保實驗室衛生安全，確保實驗室長期穩定運行。

各種變體 1.遞減PCR(touchdown PCR)：前幾循環溫度逐漸下降。

2.逆轉錄PCR(RT-PCR)：以由mRNA逆轉錄而來的DNA為模板，由此產生出來的DNA不帶有內含子(基因中不具意義的段落)，常應用於分子克隆技術。

3.熱啟動PCR(hot start PCR)：以高熱活化型核酸聚合酶進行反應，減少非專一性產物。

4.即時PCR(real-time PCR)：PCR過程中利用螢光探針或染料定量檢測，又稱定量PCR(quantitative PCR)。

5.巢式PCR(nested PCR)：先用低特異性引物擴增幾個循環以增加模板數量，再用高特異性引物擴增。

6.多重PCR(multiplex PCR)：在同一個管中使用多組引物。

7.復原條件PCR(reconditioning PCR)：PCR產物稀釋10倍後重新放入原濃度的引物和dNTP等循環3次，以消除產物中的異二聚體。

8.dsRNA合成(dsRNA replicator)：合併使用high-fidelity DNA polymersae、T7RNA聚合酶與Phi6 RNA replicase；從雙股DNA轉錄為對應的雙股RNA(dsRNA)。可應用於RNAi實驗操作。

9.COLD-PCR(co-amplification atlowerdenaturation temperature-PCR):用以檢測突變或特殊等位基因的PCR應用技術。

臨床應用

用於治療感染性疾病，腫瘤及遺傳病

感染性疾病 PCR在醫學檢驗學中最有價值的應用領域就是對感染性疾病的診斷。理論上，只要樣本有一個病原體存在，PCR就可以檢測到。一般實驗室也能檢出10~100基因拷貝，而目前病原體抗原檢測方法一般需要105-7個病原體才可檢測到。PCR對病原體的檢測解決了免疫學檢測的「窗口期」問題，可判斷疾病是否處於隱性或亞臨床狀態。

定量PCR研究資料已表明，病原體數量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有相關性。許多研究表明，人類免疫缺陷病毒(HIV)感染後，潛伏期長短和臨床症狀輕重與血液中的病毒量顯著相關；也有研究表明，HIV病毒載量低於一定值時，沒有傳染性。

在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中發現，病毒的數量與某些藥物的療效相關。例如，干擾素治療對肝炎病毒高拷貝者不敏感，低拷貝者敏感；而有些藥物則具有顯著降低病毒高拷貝的作用。

腫瘤 癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期和良性的階段就可出現。PCR技術不但能有效的檢測基因的突變，而且能準確檢測癌基因的表達量，可據此進行腫瘤早期診斷、分型、分期和預後判斷。

幾乎所有慢性骨髓性白血病患者都可檢測到原癌基因易位導致的BCR/ABL融合基因形成，定量PCR技術可通過檢測BCR/ABL融合基因的表達確定微量殘餘惡性細胞存在的數量，以此作為治療效果和估計復發的危險性的依據。

一些病毒致癌作用也與病毒載量有關，EB病毒載量的FQ-PCR檢測結果已被用於鼻咽癌早期發現和隨訪。

遺傳病 PCR技術首次臨床應用就是從檢測鐮狀細胞和β-地中海貧血的基因突變開始的。基因的突變和缺失均會引起各種珠蛋白的表達不平衡，用FQ-PCR檢測各種珠蛋白基因表達差異，是地中海貧血診斷的有效手段。

11試驗污染編輯 PCR反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。

污染原因 一、標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由於密封不嚴溢於容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，由於吸樣槍污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。

二、PCR試劑的污染：主要是由於在PCR試劑配製過程中，由於加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

三、PCR擴增產物污染：這是PCR反應中最主要最常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml），遠遠高於PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可形成假陽性。還有一種容易忽視，最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反覆吸樣都可形成氣溶膠而污染。據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。

四、實驗室中克隆質粒的污染：在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由於活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。

污染的監測 一個好的實驗室，要時刻注意污染的監測，考慮有無污染是什麼原因造成的污染，以便採取措施，防止和消除污染。

對照試驗

一、陽性對照：在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標誌。陽性對照要選擇擴增度中等、重複性好，經各種鑑定是該產物的標本，如以重組質粒為陽性對照，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）。但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經自己使用穩定，檢驗人員心中有數時，在以後的實驗中可免設陽性對照。

二、陰性對照：每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括：

1.標本對照：被檢的標本是血清就用鑑定後的正常血清作對照；被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。

2.試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增，以監測試劑是否污染。

三、重複性試驗。

四、選擇不同區域的引物進行PCR擴增。

參考文獻

[[Category:360 生物