菌种
| 菌种 |
用于发酵过程作为活细胞催化剂的微生物，包括细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。来源于自然界大量的微生物，从中经分离并筛选出有用菌种，再加以改良，贮存待用于生产。
目录
基本信息
中文名称； 菌种
注音； jūnzhǒng
释义； 食用菌组成的繁殖材料
分类； 细菌、放线菌
基本信息
简介 【注音】jūnzhǒng
【释义】是指食用菌、工业菌、农用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料。菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种菌种分为母种(一级种)、原种(二级种)和栽培种(三级种)三级。
法律规定
2006年3月中华人民共和国农业部发布的《食用菌菌种管理办法》规定:"农业部主管全国菌种工作。县级以上地方人民政府农业(食用菌，下同)行政主管部门负责本行政区域内的菌种管理工作。""县级以上地方人民政府农业行政主管部门应当加强食用菌种质资源保护和良种选育、生产、更新、推广工作，鼓励选育、生产、经营相结合。"
筛选分离
筛选
工业发酵的有用菌种，其筛选步骤包括菌种分离、初筛和复筛，挑选具有某种能力的有用菌种。
分离
首先是从土壤或腐生植物中收集含菌样品，用无菌水稀释后，涂布于置有适宜细菌、放线菌或霉菌生长的琼脂培养基平皿上，并将其倒置于恒温箱中，培养一定时间，平皿上长出的许多单个菌落(单一微生物的集落)经分别分离后即为各种纯种菌株，简称纯种，移种至试管斜面培养基上，置4℃冰箱备用。
筛选模型
根据不同的筛选目的，采用不同的筛选模型。如常规筛选抗生素产生菌的方法是将土壤中分离所得的纯种，在含有琼脂培养基的平皿上培养后，用打孔器将菌块移至含有试验菌的琼脂培养基上，在适宜的温度下培养一定时间后取出，如在菌块的周围有透明的抑菌圈，则表明此菌种具有产生抑制试验菌生长的抗菌物质的能力。所得菌种经过摇瓶液体发酵，测定发酵液或菌丝体内抗生素的含量，选出生产能力高的菌种。另一方面对所提取的抗生素进行结构分析、药理试验及临床试验等，确为有效者，即可作为生产菌种。又如筛选脂肪酶生产菌种的方法是将分离所得的霉菌涂布于含有牛脂的琼脂培养基上，恒温培养一定时间，如菌落周围出现透明圈的，则该菌具有分解脂肪的能力，进一步作摇瓶发酵测定酶活力，挑选产量高者作生产菌种的出发菌株。
改良制备
改良
即采用遗传育种的方法，使野生型菌株(从自然界分离筛选而得的出发菌株)的遗传因子 DNA发生突变、重组，从而从中选出产量高、成品质量好或具有新的培养特性如耐产物抑制、能利用廉价原料以及具有生产新品种能力的优良菌种。采用的方法有诱变育种、杂交育种、细胞融合技术和重组DNA技术。诱变育种是利用诱变因子如紫外线、钴-60、乙烯亚胺类等物理或化学诱变剂处理生产菌株的单孢子悬浮液，以获得诱发突变株。随后进行突变株的筛选，从中筛选高产菌株。由于随机的突变群体中，有益突变所占比例很低，要获得高产突变株必须进行大量筛选。可根据生物合成途径中的反应点,并通过它们的改变以提高产率或其他特性，如选育抗产物反馈抑制的突变株、增加细胞透性的突变株及营养缺陷型的突变株等。这种"理性筛选法"广泛应用于氨基酸产生菌的选育。
制备
也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及合成产物之用。种子制备包括孢子制备和菌丝体制备(见图)，其中(1)~(4)为孢子制备过程。保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，用无菌手续挑取少许，接入琼脂斜面培养基上，在25℃(或较高温度)下培养5~7天(或较长时间)。所得孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子，对于霉菌类孢子制备，多数采用大米、小米之类的天然培养基。将培养成熟的斜面孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于25~28℃培养14天。将成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4℃冰箱中备用。一次制得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。放线菌孢子的培养基大多是采用麸皮或豌豆浸出液、牛肉膏及无机盐与琼脂制成的。将斜面孢子接入扩大的扁瓶孢子培养基中,于28~37℃培养5~14天。所获得的大量孢子可直接作为种子罐 (6)的种子。如果有些生产菌种不产孢子，如赤霉素产生菌或产孢子不多的,则可采用摇瓶(5)液体培养制得菌丝体，作种子罐的种子。种子罐的目的是使接入有限的孢子或菌丝体迅速发芽、生长、繁殖成大量菌体。其中的培养基组分应是易于被菌体利用的碳源(如葡萄糖)和氮源(如玉米浆等),及无机盐(如磷酸盐)等。作为发酵罐(7)的种子应是生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮,无杂菌及异常菌体。接种量一般在10%~20%。
保存
总述
使优良菌种的性状保持稳定，人为地创造条件，使菌种的新陈代谢活动处于不活泼状态，即选取优良菌种的休眠体(孢子或芽孢)或富有生命力的悬浮液在低温或脱水状态下保存 。
低温存法
①简单保存法，将琼脂斜面孢子培养物、菌丝悬浮液以及由麸皮、大米、小米等谷物原料制成的孢子培养物置于4℃冰箱保存,保存时间不超过1~2个月，若将谷物原料制备的孢子瓶抽真空并在棉塞上浸蜡,以隔绝外界空气和水汽,保持时间可达3~4个月;②液氮超低温保存法，将生长稳定期的细胞悬浮在10%甘油或其他低冰点液体中，密封于安瓿管内，然后控制冷却速度，使安瓿管温度逐步下降至 -35℃时，即可置于-150~-196℃的液氮罐中保存。大多数微生物如病毒、噬菌体、多种细菌、放线菌、酵母和原虫、特别是一些用冷冻干燥法有困难的微生物，都可用此法长期保存。
脱水存法
①沙土保存法，能产孢子的细菌、放线菌及霉菌可采用此法保存,即将沙和土以3:2比例混合，经稀酸处理洗净过筛,装入小试管内,装置高度为1cm;灭菌2~3次，烘干后即可将在斜面培养基上生长良好的孢子，用无菌蒸馏水2~2.5ml制成孢子悬液，吸取少许加入沙土管中，经真空抽干，外观呈松散状态,于4℃冰箱保存，保存期可达5~7年。
② 冷冻干燥法,将孢子悬浮液与保护剂(一般用脱脂牛奶或血清)相混合，放在安瓿管内于-20~-30℃的乙醇浴中速冻。然后，在低温下用真空泵抽干，并用五氧化二磷或干冰使水汽结冻，熔封安瓿管，于低温下保存。保存期可达5~10年之久。
③ 石蜡油封存法，在斜面菌种培养物上,倒上灭菌后的石蜡油，高出斜面1cm，于4℃冰箱或低温干燥处保存，此法不适用于能利用石蜡油作碳源的微生物，保存期为一年以上。
食用菌
一,菌种的概念 原意是指孢子(相当于植物的种子) ,但在实际生产中,常将经过人工培养的纯菌丝体连同培养基质一同叫做菌种.
二,菌种的类型 在生产中根据菌种的来源,繁殖代数及生产目的,把菌种分为母种,原种和栽培种.分别叫一级种,二级种,三级种.
母种:将纯菌丝体或孢子在试管培养基中繁殖而成.可以繁殖原种,也适宜菌种保藏.
原种:母种菌丝在固体培养基上繁殖而成.这一过程增强菌丝对培养环境的适应性,又起到扩繁的作用.原种可以直接出菇.
栽培种:由原种扩繁而成.主要是为了扩繁,为生产提供足够的菌种
分离
为了获得某种真菌类药材的纯菌种，必须从其它微生物中分离出来，称为菌种的分离。常用的分离方法有下列3 种:
组织分离法
先将所需的野生或家种药用真菌采集回来，选取新鲜、个体大、壮实、中龄及无病虫害的子实体(或菌核、菌索)，作为分离用的材料。若为子实体，取其菌盖或菌柄组织;若为菌核，取其全部(如麦角)或部分(如茯苓)菌核;若为菌索，取其部分根状菌索(如蜜环菌)。再用0.1 %升汞或75 %酒精进行表面消毒2 分钟，用无菌水(或冷开水)冲洗数次，洗净残留的药液后切成小块。，然后，放入PDA 培养基的试管或培养皿上，置24 ~26℃温度下，培养5 ~ 7 天。在分离的真菌组织周围见长有白色菌丝时，应及时将菌丝移至斜面试管培养基上，再置温度24 ~26 ℃下培养7~10 天，即得纯菌种。所得的纯菌种还可继续扩大培养或保藏。
孢子分离
又可分为以下几种方法:
( 1 )褶上涂抹法:选取新鲜、健壮、未开伞、未破裂的子实体，洗净后用0 . 1 %升汞或75 %酒精表面灭菌2 分钟，然后连同培养基一起放入接种箱内，经福尔马林熏蒸消毒12 ~ 24 小时，再按无菌操作技术将接种环在子实体菌褶上涂抹，把涂抹后带孢子的接种环在培养基上划线接种，，最后置于25 ~ 28 ℃恒温箱内培养，可得纯菌种。
( 2 )孢子印采集法:取灭过菌的载玻片、试纸或黑布，置于新鲜、未开伞或未开裂的子体菌褶的下方。经24 小时后，便落下孢子，形成印痕(即孢子印)。然后，用接种环或玻璃棒蘸取孢子，接种在平面或斜面培养基上，进行恒温培养，可得纯菌种。
( 3 )孢子收集器采集法:孢子收集器由玻璃钟罩、培养皿、三角架、搪瓷盘等组成。钟罩下为一搪瓷盘，直径25 厘米左右，盘内先垫衬4~6 层纱布，中央放1 副9 厘米直径的培养皿，大盖口朝下，上放小的，口向上。然后，在上面小的培养皿上放1 只铅丝绕成的三角架，再将带孔的玻璃钟罩盖上，顶上罩孔用棉塞塞好，最后，用纱布包好整个孢子收集器，置于高压灭菌锅或蒸笼内灭菌2小时。
孢子收集器灭菌消毒后，放入无菌室或无菌箱内。然后，用小刀割取1 块4~5 厘米大小的子实体，插在收集器内的三角架顶上(若无孢子收集器，也可用培养皿代替)。再置于温度24 ~26 ℃下培养24 小时，培养皿中便可见到白色粉状物，此即为孢子。此时，可将孢子收集器再移至接种箱内，取出培养皿，盖好，并在培养皿内加入10 ~ 20 毫升的无菌水，使孢子散于本中，成为孢子悬浮液。然后，再用无菌打针筒或吸管吸取孢子悬浮液，接种于试管斜面培养基上，每管注2 ~ 3 滴。置于24 ~ 26 ℃温度下培养5 ~ 7 天，培养基上便可长出白色菌落。待菌落直径有0 . 5 厘米时，选健壮的菌落，再移接于另一试管的斜面培养基上培养。当白色菌丝长满试管时，便得纯菌种。
寄主分离法
即从生长有某种真菌的寄主体上(如茯苓、木耳木段)取下木片，进行分离的方法。如木耳制种时，可选野生、朵大、出耳多、质厚的耳棒(即长有木耳的木段)。采集后，削去耳根下的树皮，将其横断面锯成1 厘米厚的木片，在无菌条件下，切去无耳菌丝部分，留下有耳菌丝部分，浸入0 . 1 %升汞水中1 分钟，取出再用无菌水冲去木片上的汞液。然后，用解剖刀将木片切成0 . 5 厘米的小块，放入斜面培养基内，置24 ~26 ℃下培养，及时淘汰杂菌， 选取纯菌丝进行移植培养，即得菌种。[1]