DNA克隆

         

DNA克隆

[1]來自 搜狗 的圖片

應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質——同源或異源、原核或真核、天然或人工的DNA與載體DNA相結合成一具有自我複製能力的DNA分子——複製子，繼而通過轉化或轉染宿主細胞、篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一DNA分子，即DNA克隆。

目錄

克隆過程

一個完整的DNA克隆過程應包括：目的基因的獲取，基因載體的選擇與構建，目的基因與載體的拼接，重組DNA分子導入受體細胞，篩選並無性繁殖含重組分子的受體細胞（轉化子）。

目的基因獲取

利用重組DNA技術構建嵌合DNA時，欲插入載體DNA的外源DNA片段中含有我們感興趣的基因或DNA序列—目的基因。獲取目的基因大致有如下幾種途徑或來源。

化學合成法

如果已知某種基因的核苷酸序列，或根據某種基因產物的氨基酸序列推導出該多肽編碼基因的核苷酸序列後，再利用DNA合成儀通過化學合成原理合成目的基因。利用該法合成的基因有人生長激素釋放抑制因子、胰島素原、腦啡肽及干擾素基因等。

基因組DNA

分離組織或細胞染色體DNA，利用限制性核酸內切酶將染色體DNA切割成基因水平的許多片段，其中即含有我們感興趣的基因片段。將它們與適當的克隆載體拼接成重組DNA分子，繼而轉入受體菌擴增，使每個細菌內都攜帶一種重組DNA分子的多個拷貝。不同細菌所包含的重組DNA分子內可能存在不同的染色體DNA片段，這樣生長的全部細菌所攜帶的各種染色體片段就代表了整個基因組。存在於細菌內、由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合稱基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)。基因組DNA文庫就象圖書館庫存萬卷書一樣，涵蓋了基因組全部基因信息，也包括我們感興趣的基因。建立基因文庫後需要結合適當篩選方法從眾多轉化子菌落中篩選出含有某一基因的菌落，再進行擴增，將重組DNA分離、回收，獲得目的基因的無性繁殖系—克隆。

cDNA

以mRNA為模板，利用反轉錄酶合成與mRNA互補的DNA(complementary DNA，cDNA)，再複製成雙鏈cDNA片段，與適當載體連接後轉入受菌體，擴增為cDNA文庫(cDNA library)，然後再採用適當方法從cDNA文庫種篩選出目的cDNA。與基因組DNA文庫類似，由總mRNA製作的cDNA文庫包括了細胞全部mRNA信息，自然也含有我們感興趣的編碼cDNA。當前發現的大多數蛋白質的編碼基因幾乎都是這樣分離的。

選擇與構建

外源DNA片段離開染色體是不能複製的。如果將外源DNA連接到複製子上，外源DNA則可做為複製子的一部分在受體細胞中複製。這種複製子就是克隆載體。重組DNA技術中克隆載體的選擇和改進是一項極富技術性的專門工作，目的不同，操作基因的性質不同，載體的選擇和改建方法也不同。

導入受體菌

外源DNA（含目的DNA）與載體在體外連接成重組DNA分子（嵌合DNA）後，需將其導入受體菌。隨着受體菌的生長、增殖，重組DNA分子也複製、擴增，這一過程即為無性繁殖；篩選出的含目的DNA的重組體分子即為一無性繁殖系或克隆。在選擇適當的受體菌後，經特殊方法處理，使之成感受態細胞 (competent cell)，即具備接受外源DNA的能力。根據重組DNA時所採用的載體性質不同，導入重組DNA分子有轉化(transformation)、轉染(transfection)和感染(infection)等不同手段。