熒光假單胞菌

原圖鏈接中國科學院微生物研究所

熒光假單胞菌（P.Fluorescens）是一種環境污染菌。對於人類是一種罕見的機會致病菌。熒光假單胞菌屬於假單胞菌屬，是化能異養型的革蘭氏陰性菌，呈杆狀，有鞭毛。能分泌黃綠色熒光色素髮出熒光，能產生抗生素、水解酶等代謝產物，在 4℃-37℃範圍內，中性環境中生長，生理生化特性顯著，是作為嗜冷菌是牛奶中危害最大的微生物。

目錄

生物學作用

以原核生物16S保守序列設計引物，用PCR方法，從熒光假單胞菌基因組中擴取其16S保守序列，連接到T-載體，以設計好的限制性內切酶，分別切割表達載體（pET32a、pMAL-c2、pGEX-6p-1 ）和目的基因，然後將目的基因與表達載體連接，轉化大腸桿菌表達宿主菌（BL21、Origami），並以酶切方法驗證連接的正確性；誘導表達後即可得到LPL（脂蛋白脂肪酶）

熒光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens)

分類學上屬於細菌域、變形菌門、γ-變形菌綱、假單胞菌目、假單胞菌科的假單胞菌屬。細胞為直的桿菌，大小為0.7-0.8X2.3-2.8 微米，不產芽孢，革蘭氏染色陰性。有數根極生鞭毛，運動。需氧,進行嚴格的呼吸型代謝,以氧為最終電子受體。能以硝酸鹽為替代的電子受體進行厭氧呼吸。化能營養異養，不需要有機生長因子。氧化酶陽性，接觸酶陽性。能利用葡萄糖和果糖，有些菌株能從蔗糖合成果聚糖，明膠液化。生長溫度範圍 4-37℃，最適生長溫度是25-30℃。 DNA中G+C 含量是60-61%。廣泛分布於自然界，如土壤、水、植物及動物活動環境中。該菌生化能力活躍，可降解許多人工合成化合物，常被用於環境保護。

還是一種重要的植物根際促生細菌,是已知植物根際有益微生物中種群數量較多的細菌種類之一。該菌營養需要相對簡單,能夠利用根系分泌物中大部分營養迅速在植物根圍定殖。其中一些菌株具有促進植物生長和防治病害的作用,因而可能用於植物病害的生物防治。

臨床意義

可從傷口、痰、胸水、尿和血液中分離出來，也可從血庫存在中分離出。可在冰箱儲存的血液及血液製品中繁殖，而且自溶後釋放內毒素。其內毒素的磷脂部分，可導致輸血後不可逆的休克。

相關污染事例

【北京工商局稱「發光豬肉」為細菌引起】北京市工商局13日回應稱，北京市食品安全監控中心對送檢「發光豬肉」樣本進行了檢測，送檢樣本均未檢出熒光增白物質，但檢出了熒光假單胞菌。專家表示，這種細菌並不可怕，對正常人群不具有致病性，只要豬肉本身沒有腐敗變質，煮熟即可殺滅該細菌。（新京報）

熒光假單胞菌的檢測方法

我國對乳製品中嗜冷菌數量的檢測採用國家標準NYT 1331-2007中平板計數的方法，對熒光假單胞菌沒有專門的國標，但是國內外對熒光假單胞菌檢測技術有豐富的研究。

平板計數法 國際乳品聯合會（IDF）採用 IDF Standard 101A 和 IDF Standard 132A檢測標準，前者採用 6.5℃培養10天後平板計數，後者 21℃培養 25h後計數，132A培養時間短穩定性好，菌數較為準確。平板計數法將原料乳稀釋後，採用塗布法，傾注法，3M細菌總數試紙等方法進行計數，傾注法由於溫度較高導致精確度較低，3M 試紙精確度和效率較高。平板計數法是傳統的檢測方法，計數準確，但耗時太長，25h遠達不到工業生產快速檢測的要求。

直接熒光過濾法 直接熒光法DEFT（Direct Epifluorescent Filter Technique）是利用電離輻射對食品樣品菌落計數的方法，操作簡便，具有高通量性。將樣品通過過濾器後，吖啶橙染色，在紫外顯微鏡下活細胞能觀察到橘黃色，而死細胞染成綠色，可以統計出樣品中所有菌落的總數。原料乳用濾膜過濾後染色，計數得熒光假單胞菌相關性係數為0.91，且在25min內完成檢測。相對於傳統的平板計數方法，DEFT 大大縮短檢測時間，利用其原理，可以實現對多種食品中菌落數的快速檢測。但是 DEFT 的靈敏度不高，只能用於檢測一定範圍內菌落數，當食品中菌數含量較少時沒有良好的線性關係，且實驗儀器比較昂貴，在工業生產中不能很好的適用。

流式細胞法 流式細胞法FCM（Flow Cytometry Method）可以檢測菌液中標記熒光信號的單細胞，對菌株實現逐一定量分析。流式細胞法檢出的菌數是平板計數法的 3.8 倍，因為能統計到總體菌落數量。利用這個方法檢測牛奶中假單胞菌，能在4 h內完成檢測，且在菌落數含量較少時靈敏度有很大的提高。此方法可以快速準確的檢測原料乳中熒光假單胞菌含量，但流式細胞法操作過程較為複雜，且容易被多種因素影響檢測到的結果。

PCR法 針對16S rRNA 保守序列設計引物，通過 PCR 擴增，可以將牛奶中嗜冷菌擴增出147bp的 DNA片段，標記後用 ELISA 檢測，得到熒光假單胞菌AH-70 的OD450和菌濃度的方程，分析得此方法和平板計數法的相關係數達到 0.94，可以檢測菌濃度範圍是103-107CFU/mL。PCR 檢測具有很高的靈敏度，特異性較強，有文獻報道當原料奶中埃希腸桿菌的濃度達到 10CFU/mL 時能被檢測出來。PCR 檢測菌落數結果同樣會受到死菌株數的影響，而且在現實生產中對食品提取可以PCR擴增的DNA難度很大，容易被食品體系中因素影響精確度。

氨肽酶法 氨肽酶法通過革蘭氏陰性菌細胞壁上的氨肽酶與特定的化合物反應，檢測氨肽酶的活性。呂元等人用氨肽酶法，對杭州地區原料奶中熒光假單胞菌，阪崎腸桿菌和魯氏不動桿菌 3 種優勢嗜冷菌進行快速檢測。結果得出 3 種菌的濃度和氨肽酶活性存在顯著的相關性，且與傳統的平板計數法的結果沒有顯著差異，可以在很大程度上縮短檢測的時間。在檢測冷藏肉類中嗜冷菌報道，氨肽酶法的檢測範圍是104-108CFU/mL，檢測時間為2.5 h，與平板計數法結果的相關性為0.88。顯然氨肽酶法能達到快速檢測的效果，氨肽酶法適用於定性檢測，可以根據反應顏色用肉眼觀察，但檢測靈敏度較其他方法差，最大的問題是原料樣品中的革蘭氏陽性菌無法被檢出，導致實驗結果偏差。

ELISA法 ELISA 法通過抗體特異性反應檢測菌落數，具有高靈敏性，也易於同其他方法結合。PicardC 等人通過測定酪蛋白糖多肽計算原料乳中嗜冷菌含量。利用單克隆抗體，檢測出成品奶樣中嗜冷菌，與平板計數法相關性達 0.96。從脫脂奶粉中檢測6種沙門氏菌，檢出線為10 CFU/mL，檢測時間為3h。CrociL等人在對豬肉樣品的檢測中，將 ELISA 方法和 PCR 法、平板計數進行對比，得出前面兩者都較為靈敏，最低檢出線為1-10個/25g，檢測結果符合 ISO 規定。

免疫磁珠法 免疫磁珠技術可以快速的富集乳製品中低濃度的菌，通過結合 PCR、ELISA等方法可以達到快速、準確的檢測目的。呂琦等人通過對 4 中菌保守序列基因設計引物，建立多重 PCR 體系，在7-8h檢測時間內，檢測靈敏度達到 102CFU/mL，具有特異性。免疫磁珠技術檢測在各個方面都表現出一定優勢，改進得到嗜冷菌的保守序列能表現高通量性。對於免疫磁珠技術檢測乳製品中菌濃度的研究報道較少，但是應用於檢測有害化合物的研究都比較成熟，應用廣泛。