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分子克隆-選殖。原圖鏈接

分子克隆（英語：Molecular cloning，中文譯:分子純化繁殖，簡稱分子選殖），分子克隆是分子生物學中的一組實驗方法，用於組裝重組DNA分子並指導其在宿主生物體內複製 。分子克隆通常使用來自兩種不同生物的DNA序列：一種是要克隆的DNA的來源；另一種將用作重組DNA複製的活宿主，分子克隆方法對於現代生物學和醫學的許多當代領域至關重要。

簡介

轉基因微生物

分子克隆是分子的純化繁殖，即分子選殖，「 克隆 」一詞的使用是指以下事實：該方法涉及複製一個分子以產生具有相同DNA分子的細胞群體。而選殖英文字面上的意思，就是分子複製，定義是指分離一個已知DNA序列，並以in vivo（活體內）方式獲得許多複製品的過程。這一複製過程經常被用於增加並獲取DNA片段中的基因，但因為這個方法本身使用了基因剪貼的技術，也可用來增加某些任意的DNA序列，如啟動子、非編碼序列、化學合成的寡核苷酸或是隨機的DNA片段。

在常規的分子克隆實驗中，要克隆的DNA是從目標生物中獲得的，然後在試管中用酶處理以生成較小的DNA片段。隨後，這些片段然後與載體DNA結合以產生重組DNA分子。 然後將重組DNA引入宿主生物（通常是易於生長，良性的大腸桿菌細菌實驗室菌株）。 這將產生一群生物，其中重組DNA分子與宿主DNA一起復制。 因為它們包含外源DNA片段，所以它們是轉基因或轉基因微生物（GMO）。

任何DNA序列都可以選殖和擴增

該過程利用了一個事實，即可以誘導單個細菌細胞吸收並複製單個重組DNA分子。 然後可以使該單個細胞按指數方式擴增以產生大量細菌，每個細菌都包含原始重組分子的副本。因此，所得細菌群體和重組DNA分子都通常稱為「克隆」。嚴格來說，重組DNA是指DNA分子，而分子克隆是指用於組裝它們的實驗方法。提出的想法是，可以將不同的DNA序列插入質粒，並將這些外源序列帶入細菌並作為質粒的一部分進行消化。亦即這些質粒可以用作攜帶基因的克隆載體。

幾乎任何DNA序列都可以克隆和擴增，但是有些因素可能會限制該過程的成功。難以克隆的DNA序列的例子是反向重複，複製起點，著絲粒和端粒。限製成功機會的另一個特徵是DNA序列的大小。 大於10kbp的插入片段獲得的成功非常有限，但是可以修飾噬菌體（例如噬菌體λ）以成功插入高達40 kbp的序列。

歷史記錄

在1970年代之前，由於無法從復雜的生物體中分離和研究單個基因而嚴重阻礙了對遺傳學和分子生物學的理解。 隨著分子克隆方法的出現，這種情況發生了巨大變化。微生物學家試圖了解細菌限制細菌噬菌體生長的分子機制，即分離的限制性核酸內切酶 ，這些酶只有在遇到特定的DNA序列時才能切割DNA分子。他們表明限制酶在特定位置切割了染色體長度的DNA分子，並且較大分子的特定部分可以通過大小分級純化。 使用第二種酶DNA 連接酶 ，可以將限制酶產生的片段連接到稱為重組DNA的新組合中。

通過將目標DNA片段與在細菌內部自然複製的載體DNA（例如噬菌體或質粒）重組，可以在細菌培養物中產生大量純化的重組DNA分子。1972年產生並研究了第一個重組DNA分子。

概述

分子克隆利用了以下事實：DNA在所有活生物體中的化學結構基本相同。 因此，如果將來自任何生物的DNA的任何片段插入到包含DNA複製所需分子序列的DNA片段中，並將所得的重組DNA引入獲得複制序列的生物中，則外源DNA將被複製以及轉基因生物中宿主細胞的DNA。

分子克隆與聚合酶鏈反應（PCR）相似，因為它允許複製DNA序列。 兩種方法之間的根本區別在於，分子克隆涉及在活微生物中複製DNA，而PCR在沒有活細胞的體外溶液中複製DNA。

步驟

在標準分子克隆實驗中，任何DNA片段的克隆基本上都涉及以下幾個步驟：

• （1）選擇宿主生物和克隆載體。
• （2）製備載體DNA。
• （3）製備要克隆的DNA。
• （4）創建DNA的重組。
• （5）將重組DNA引入宿主生物。
• （6）選擇含有重組DNA的生物，篩選具有所需DNA插入片段和生物學特性的克隆。

值得注意的是，DNA合成平台的能力和保真度不斷提高，使得分子工程學中的設計越來越複雜。 這些項目可能包括很長的新DNA序列鍊和/或同時測試整個文庫，而不是單個序列。這些變化帶來了複雜性，要求設計從基於平面核苷酸的表示形式向更高的抽像水平轉變。此類工具的示例包括GenoCAD ，Teselagen 或GeneticConstructor（學術界免費）。

宿主生物和克隆載體的選擇

儘管使用了大量的宿主生物和分子克隆載體，但絕大多數分子克隆實驗始於實驗室細菌大腸桿菌（大腸桿菌）和質粒克隆載體 。大腸桿菌和質粒載體之所以被普遍使用，是因為它們在技術上很先進，用途廣泛，用途廣泛，並且只需最少的設備即可快速生長重組生物。如果要克隆的DNA非常大（數十萬至數百萬個鹼基對），那麼通常會選擇細菌人工染色體或酵母人工染色體載體。

專門的應用程序可能需要專門的宿主向量系統。例如，如果實驗者希望從重組生物中收穫特定蛋白質，則選擇表達載體 ，其包含用於在所需宿主生物中轉錄和翻譯的適當信號。或者，如果需要在不同物種中複製DNA（例如，將DNA從細菌轉移到植物中），則可以選擇多個宿主範圍的載體（也稱為穿梭載體 ）。然而，實際上，專門的分子克隆實驗通常始於克隆到細菌質粒中，然後再亞克隆到專門的載體中。

無論使用宿主和載體的任何組合，載體幾乎總是包含四個DNA片段，這些片段對其功能和實驗用途至關重要：

• DNA複製起點是載體（及其連接的重組序列）在宿主生物體內復制所必需的
• 一個或多個獨特的限制性核酸內切酶識別位點 ，用作可能引入外源DNA的位點
• 可選擇的遺傳標記基因，可用於使攝取載體序列的細胞存活
• 標籤基因，可用於篩選含有外源DNA的細胞

載體DNA的製備

用限制性核酸內切酶處理克隆載體，以在將要插入外源DNA的位點切割DNA。選擇限制酶以在切割位點產生與外源DNA的末端相容的構型。通常，這通過用相同的限制酶例如EcoRI切割載體DNA和外源DNA來完成。 大多數現代載體都包含各種方便的切割位點，這些位點在載體分子內是唯一的（因此，該載體只能在單個位點上被切割），並且位於一個基因（通常是β-半乳糖苷酶 ）中，其失活可以用來區分從非重組生物體中重組而來。 為了提高重組生物與非重組生物的比例，可以使用使載體末端去磷酸化的酶（ 鹼性磷酸酶 ）處理裂解的載體。 具有去磷酸化末端的載體分子無法複製，並且只有在將外源DNA整合到切割位點的情況下才能恢復複製。

準備要克隆的DNA

為了克隆基因組DNA，從目的生物中提取要克隆的DNA。 實際上，可以使用任何組織來源（甚至包括滅絕動物的組織），只要DNA不會被廣泛降解。 然後使用簡單的方法純化DNA，以去除污染的蛋白質（用苯酚提取），RNA（核糖核酸酶）和較小的分子（沉澱和/或色譜法）。聚合酶鏈反應（PCR）方法通常用於在分子克隆之前擴增特定的DNA或RNA（RT-PCR）序列。

用於克隆實驗的DNA也可以使用逆轉錄酶（ 互補DNA或cDNA克隆）從RNA中獲得，或以合成DNA的形式（ 人工基因合成 ）獲得。 cDNA克隆通常用於獲得代表目的細胞mRNA種群的克隆，而合成DNA用於獲得設計者定義的任何精確序列。當跨遺傳密碼-例如，從線粒體到細胞核）移動基因時，或者僅通過密碼子優化來增加表達時，可能需要這種設計的序列。

然後用限制酶處理純化的DNA以產生末端能夠與載體末端連接的片段。 如有必要，可以添加含有所需限制位點的短雙鏈DNA片段（接頭），以創建與載體相容的末端結構。

用DNA連接酶創建重組DNA

在許多方面，重組DNA的產生是分子克隆過程中最簡單的步驟。從載體和外源製備的DNA可以簡單地以適當的濃度混合在一起，並暴露於將末端共價連接在一起的酶（DNA連接酶 ）中。這種連接反應通常稱為連接 。然後準備將包含隨機連接末端的所得DNA混合物引入宿主生物中。

DNA連接酶僅識別並作用於線性DNA分子的末端，通常導致末端隨機連接的DNA分子的複雜混合物。 將會存在所需的產物（與外源DNA共價連接的載體DNA），但通常還會存在其他序列（例如，與自身連接的外源DNA，與自身連接的載體DNA以及載體和外源DNA的高階組合）。在將DNA混合物引入細胞後，在克隆過程的後續步驟中分選出這種複雜的混合物。

將重組DNA引入宿主生物

先前在體外操作過的DNA混合物被移回到稱為宿主生物的活細胞中。使DNA進入細胞的方法多種多樣，在分子克隆過程中此步驟的名稱通常取決於所選擇的實驗方法（例如，轉化，轉導，轉染，電穿孔 ）。

當微生物能夠從其本地環境中吸收並複制DNA時，該過程稱為轉化 ，而處於生理狀態以使它們可以吸收DNA的細胞被稱為是有能力的。在哺乳動物細胞培養中，將DNA引入細胞的類似過程通常稱為轉染 。轉化和轉染通常都需要通過特殊的生長機制和化學處理過程來製備細胞，該過程會隨所使用的特定物種和細胞類型而變化。

電穿孔使用高壓電脈衝使DNA跨細胞膜[和細胞壁（如果存在）]轉移。相反， 轉導涉及將DNA包裝到病毒衍生的顆粒中，並使用這些病毒樣顆粒通過類似於病毒感染的過程將封裝的DNA引入細胞。 儘管電穿孔和轉導是高度專業化的方法，但它們可能是將DNA移入細胞的最有效方法。

選擇含有載體序列的生物

無論使用哪種方法，將重組DNA引入所選宿主生物中通常都是低效率的過程。 也就是說，只有一小部分細胞會真正吸收DNA。 實驗科學家通過人工遺傳選擇的步驟解決了這個問題，在該步驟中，未吸收DNA的細胞被選擇性殺死，只有那些能夠主動複製含有該載體編碼的選擇標記基因的DNA的細胞才能存活。

當細菌細胞用作宿主生物時， 選擇標記通常是賦予對抗生素的抗性的基因，否則該抗生素會殺死細胞，通常是氨芐青黴素 。帶有質粒的細胞在暴露於抗生素後將存活，而那些未能吸收質粒序列的細胞將死亡。 當使用哺乳動物細胞（例如人或小鼠細胞）時，使用類似的策略，除了標記基因（在這種情況下通常編碼為kanMX盒的一部分）賦予對抗生素遺傳黴素的抗性 。

篩選具有所需DNA插入片段和生物學特性的克隆

現代細菌克隆載體（例如pUC19和後來的衍生物，包括pGEM載體）使用藍白色篩選系統將轉基因細胞的菌落（克隆）與包含親本載體的菌落（即未插入重組序列的載體DNA）區分開。 在這些載體中，將外源DNA插入編碼β-半乳糖苷酶（該酶的活性導致在用於此工作的培養基上形成藍色菌落）形成的部分的序列中。將外源DNA插入β-半乳糖苷酶編碼序列會使酶功能失效，從而使含有轉化DNA的菌落保持無色（白色）。 因此，實驗人員能夠輕鬆地鑑定和進行轉基因細菌克隆的進一步研究，而忽略那些不包含重組DNA的克隆。

在分子克隆實驗中獲得的單個克隆的總種群通常被稱為DNA文庫。庫可能非常複雜（如從生物體中克隆完整的基因組DNA）或相對簡單（如將先前克隆的DNA片段移入其他質粒時），但是幾乎總是需要檢查許多不同的克隆以確保獲得所需的DNA構建體。 這可以通過非常廣泛的實驗方法來完成，包括使用核酸雜交，抗體探針，聚合酶鏈反應，限制性片段分析和/或DNA測序 。

應用程序

分子克隆為科學家提供了無限量的，來自任何基因組的任何單個DNA片段。 該材料可用於多種用途，包括基礎生物學和應用生物學的目的。這裡總結了一些更重要的應用程序。

基因組組織和基因表達

分子克隆直接導致闡明了許多物種基因組的完整DNA序列，並探索了單個物種內的遺傳多樣性，而這項工作主要是通過確定大量隨機DNA序列來完成的。克隆基因組片段，並組裝重疊序列。

在單個基因的水平上，分子克隆被用於生成探針，用於檢測基因的表達方式，以及該表達方式與生物學中的其他過程（包括代謝環境，細胞外信號，發育，學習，衰老和細胞死亡。 克隆的基因還可以通過允許研究人員使基因失活或使用區域誘變或定點誘變進行更細微的突變，從而提供工具來檢查單個基因的生物學功能和重要性。克隆到表達載體中進行功能克隆的基因提供了一種根據表達的蛋白質功能篩選基因的方法。

重組蛋白的生產

獲得基因的分子克隆可以導致產生被克隆的基因的蛋白質產物的生物的發展，所述蛋白質產物被稱為重組蛋白。在實踐中，與克隆基因相比，開發出可產生所需數量的活性形式的重組蛋白的生物通常更加困難。這是因為用於基因表達的分子信號是複雜且可變的，並且因為蛋白質折疊，穩定性和運輸可能非常具有挑戰性。

當前，許多有用的蛋白質可以作為重組產物獲得 。這些包括-

• （1）具有醫學用途的蛋白質，其給藥可糾正有缺陷或表達不佳的基因（例如重組凝血因子VIII ，某些形式的血友病缺乏的凝血因子和重組胰島素 ，用於治療某些形式的糖尿病）。
• （2）可用於協助危及生命的緊急情況的蛋白質（例如，用於治療中風的組織纖溶酶原激活物），
• （3）重組亞單位疫苗，其中純化的蛋白質可用於免疫患者的傳染病，而無需將其暴露於傳染原本身（例如，B型肝炎疫苗）
• （4）重組蛋白作為診斷實驗室測試的標準材料。

轉基因生物

一旦進行了表徵和操縱以提供適當表達的信號，就可以將克隆的基因插入生物體中，從而產生轉基因生物體，也稱為轉基因生物體（GMO）。儘管大多數轉基因生物都是出於基礎生物學研究的目的而產生的，但已經開發出許多用於商業用途的轉基因生物，其範圍從生產藥物或其他化合物（製藥）的動植物，抗除草劑作物植物和用於家庭娛樂的熒光熱帶魚GloFish。

基因療法

基因治療涉及向缺乏該功能的細胞提供功能基因，目的是糾正遺傳性疾病或獲得性疾病。 基因治療大致可分為兩類。 首先是生殖細胞的變化，即精子或卵子的變化，導致整個生物體及其後代的永久性遺傳變化。 許多人認為這種「生殖系基因療法」在人類中是不道德的。第二種基因療法，即「體細胞基因療法」，類似於器官移植。 在這種情況下，通過直接治療或通過去除組織，在實驗室中添加一種或多種治療基因，以及將治療後的細胞返回給患者來靶向一種或多種特定組織。 體細胞基因療法的臨床試驗始於1990年代後期，主要用於癌症，血液，肝臟和肺部疾病的治療。

儘管進行了大量宣傳和承諾，但人類基因治療的歷史一直以相對有限的成功為特徵。將基因導入細胞的效果通常只能促進部分和/或暫時緩解所治療疾病的症狀。一些基因治療試驗患者遭受了治療本身的不利後果，包括死亡。在某些情況下，不良反應是由於插入失活而破壞了患者基因組內必需基因的結果。 在其他情況下，用於基因治療的病毒載體已被傳染性病毒污染。然而，基因治療仍然被認為是有前途的醫學未來領域，並且是一個有大量研究和開發活動的領域。

視頻

【消失的國界】基改解藥！自然手法「分子選種技術」/李天怡主持/三立新聞台]]

Molecular Cloning Lab(分子克隆實驗室)

DNA cloning(DNA克隆)