利用生物反应器规模化繁殖林药植物技术应用案例

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利用生物反应器规模化繁殖林药植物技术应用案例由于多年的滥采滥挖，东北丰富的林下野生资源破坏严重，很难可持续利用。人工栽培中大田栽培农药、重金属等污染严重。

目录

一、应用场景

由于多年的滥采滥挖，东北丰富的林下野生资源破坏严重，很难可持续利用。人工栽培中大田栽培农药、重金属等污染严重。林区栽培，大面积林坡地开荒栽培，毁林倾向严重，森林生态环境破坏较大，因此急需要补充开发可持续、安全生产林药植物原料的生产途径。本技术利用人参、刺五加、楤木等林下珍稀药用植物进行外植体规模化繁殖条件与活性物质稳定积累机制研究。提高繁殖效率，降低培养成本，优化珍稀濒危植物离体繁殖技术，实现规模化生产林要植物原料，实现资源的可持续利用。2016在东北林业大学实验室开展该技术试验应用。

二、主要解决的问题

离体繁殖过程中活性物质的稳定积累，为高效获得天然活性物质奠定基础。通过植物组织培养开发可稳定继代，并高量积累目标三萜皂苷的组织与细胞，通过外源诱导物提升目标皂苷含量，开发低成本诱导离体繁殖技术，有效提升离体繁殖过程中活性物质的积累效率，是本技术的主要研究内容及拟解决的科学问题。

三、技术要点

该技术探索外植体类型、培养基成分、空气剪切力与诱导子等培养条件影响繁殖效率的作用机制，建立高效离体培养体系。

1.建立了楤木、刺五加、人参等五加科植物的离体繁殖体系

1.1建立了人参不定根及胚性细胞的离体繁殖体系

人参不定根培养体系的建立及皂苷诱导：本项目组建立了人参不定根的生物反应器培养体系。由固体培养基到液体培养基，由摇瓶到10 L生物反应器，见下图。图1.1-1的图A到图B状态需要经过1个月的室温暗培养，然后收集30 g人参不定根接种至三角瓶中进行7天振摇培养（图1.1-1），之后接种至10 L生物反应器中，进行7周时间的培养，人参不定根达到图D的状态，培养50天的时候，加入MeJA进行诱导，3天后可以进行人参不定根的收集。MeJA处理的人参不定根与5年生人参比较，发现人参不定根中的人参皂苷Rb1、Rd、F2及总皂苷含量与5年生人参中皂苷含量基本一致。

大型生物反应器人参不定根培养体系的建立：10 L生物反应器中培养3-4周，转入5吨生物反应器中（图1.1-2），培养6-7周人参不定根生物量增加30倍以上，通过MeJA处理诱导，人参中皂苷含量可达到大田或林下栽培5-10年生的人参中的皂苷含量。获得多项发明专利及设备开发的实用新型专利，部分专利已转让企业，帮助企业进一步优化和开发生产平台。

（A）人参不定根的固体培养；

（B）固体培养1个月后的人参不定根；

（C）人参不定根的液体培养；

（D）人参不定根的生物反应器培养；

（E）人参不定根与5年生人参中主要人参皂苷的比较。

1.2建立了楤木胚性细胞的离体繁殖体系

生物反应器中胚性细胞的培养：利用种子诱导的楤木的胚性愈伤组织建立了5L、10L生物反应器楤木体细胞胚培养体系，并使用不添加植物生长调节剂的液体培养基，在5L生物反应器中分别转入体细胞胚进行悬浮培养，培养7周后，体细胞胚都发育长成幼苗。干重增加5-7倍左右，而且通过高效液相色谱分析该细胞系中齐墩果酸的含量可达5.46%，而栽培叶中的仅为0.56%，组培苗中的齐墩果酸含量为2.03%。因此利用组培技术生产齐墩果酸很有实际可行性。

1.3建立了刺五加胚性细胞的离体繁殖体系

外植体的诱导：通过外植体筛选实验，我们从4年生刺五加的幼茎、叶柄和幼根外植体在添加1.0-4.0 mg/L 2,4-D的培养基成功诱导胚性愈伤组织，其中叶柄的诱导率最高为3%。在添加1.0 mg/L 2,4-D的培养基增殖和维持的胚性愈伤组织，当转到不含植物生长调节物质的固体培养基培养时，可以分化形成大量体细胞胚。

生物反应器中胚性细胞的培养：建立了刺五加体细胞胚培养的10L生物反应器中的培养体系，并使用不加植物生长调节剂的液体培养基，在250ml三角瓶培养400 mg胚性细胞团，4周后发育成3.1g心形胚，转到10L生物反应器培养4周，得到约75g鱼雷形胚，分到4个生物反应器培养40天，每个生物反应器可得到1208.4 g发芽的体胚。