刺盤孢屬檢視原始碼討論檢視歷史
| 刺盤孢屬 |
刺盤孢屬黑盤泡目(14velanconiaIes)中的一屬，包括許多重要的植鈞病原菌，如i"蔥斑點病和一!!一蔗紅腐病的致病菌。
特性
黑盤泡目(14velanconiaIes)中的一屬，包括許多重要的植鈞病原菌，如i"蔥斑點病和一!!一蔗紅腐病的致病菌。刺盤袍屬的許多種形成細民無I'h5而缺乏附1}絲的分生抱子。分生泡子長在分生抱子便上，而分生抱子梗則長在被有剛毛的分生抱子盤之內。[1] 刺盤孢屬(colletotrichum，又名炭疽菌屬)，由corda在1831年建立，隸屬於小叢殼目(glomerellales)、小叢殼科(glomerellaceae)。該屬中大多數都是植物病原真菌，可以侵害多種農作物、經濟作物和觀賞植物等，形成以炭疽病為主的多種病害，被認為是世界十大重要植物病原真菌之一(deanetal.2012)。其中造成重大經濟損失的病原菌包含咖啡漿果刺盤孢colletotrichumkahawaesubsp.kahawae、暹羅刺盤孢c.siamense、膠孢刺盤孢c.gloeosprioides、果生刺盤孢c.fructicola、平頭刺盤孢c.truncatum、尖孢刺盤孢c.acutatum、博寧刺盤孢c.boninense、菜豆刺盤孢c.lindemuthianium、鐮形刺盤孢c.falcatum等。其中，咖啡漿果刺盤孢c.kahawaesubsp.kahawae已被列入中國和亞洲其他國家以及拉丁美洲的一些國家檢疫名錄中，該種是造成整個非洲廣泛種植的阿拉伯咖啡漿果病害的罪魁禍首，能夠造成毀滅性的咖啡漿果炭疽病害，損失高達30％-70％，甚至絕產，是重要植物檢疫對象。刺盤孢屬病菌是檢疫口岸檢出頻次最高的有害植物病原真菌之一。區分和鑑定刺盤孢屬真菌對口岸檢疫人員來說不僅任務繁重，而且是一個很大的挑戰。
有害生物入侵的超前預警、快速檢測、風險分析和科學控制是防範外來物種的核心內容，其中，有害生物鑑定是其中的首要環節。對咖啡漿果刺盤孢及其近緣種進行有效識別，對於控制其危害，及時阻斷其傳播、擴散，起着至關重要的作用。目前，進出境口岸對檢疫性刺盤孢種類鑑定的主要流程是菌株分離、形態觀察、序列測定和分析，但是這樣的操作遠遠不能滿足口岸部門對於有害病原菌高效、精準的檢出要求。儘管現有技術中已有一些利用分子生物學手段進行刺盤孢屬某些物種的特異性檢測和鑑定，如：巢式pcr快速檢測膠胞炭疽菌的體系建立及應用(cn201810429586.1)、一種定量檢測芒果炭疽菌的方法(cn201810062983.x)、一種檢測膠孢炭疽菌的環介導等溫擴增引物組合物及其應用(cn201510030095.6)、一種檢測平頭炭疽菌的環介導等溫擴增引物組合物及其應用(cn201510031690.1)。但是，這些方法每次只能檢測一種刺盤孢屬物種，普適性較差，在檢疫性鑑定應用方面存在缺陷，不能滿足口岸日常檢測篩查的需要。
因此，建立刺盤孢屬的屬水平病原菌的特異、靈敏、快速和有效的分子檢測方法在實踐和應用研究中是十分必要的。技術實現要素：為解決現有技術中存在的技術問題，本發明的目的在於提供一種普遍適用於各種刺盤孢屬真菌的特異、靈敏、快速的刺盤孢屬真菌的鑑定方法。為實現上述目的，本發明的技術方案如下：本發明通過對刺盤孢屬真菌物種、同科近緣屬以及其它常見真菌(尤其是常見植物病原真菌)的基因組序列進行大量的分析和比對，確定了在刺盤孢屬真菌中高度保守且具有屬特異性的、能夠很好地適用於各種刺盤孢屬真菌的特異性靶序列以及特異性引物對和探針，該特異性引物對可以單獨用於刺盤孢屬真菌的pcr鑑定，也可結合特異性探針使用利用熒光定量pcr進行刺盤孢屬真菌的鑑定。
上述特異性引物或特異性引物探針組合能夠實現刺盤孢屬真菌的特異、靈敏、準確、快速鑑定。具體地，第一方面，本發明提供一種用於鑑定刺盤孢屬真菌的靶序列，其位於28srdna上，含有序列如seqidno.1-2所示的引物對特異性結合或擴增的核苷酸序列。本發明中，上述靶序列可通過序列如seqidno.1-2所示的引物對擴增得到，或者含有序列如seqidno.1-2所示的引物對能夠特異性結合的核苷酸序列同時能夠採用如seqidno.1-2所示的引物對或如seqidno.1-2所示的引物對經一個或多個鹼基的缺失、替換或插入得到的引物對擴增得到。上述靶序列在刺盤孢屬真菌中具有較高的保守性，尤其在特定位置具有高度的保守性，同時具有刺盤孢屬真菌的屬特異性，能夠普遍通用於不同種刺盤孢屬真菌的鑑定。上述特異性靶序列在不同的刺盤孢屬真菌中存在部分位點的核苷酸序列差異，例如：當目標菌株為colletotrichumtruncatumcbs151.35時，上述靶序列的核苷酸序列如seqidno.4所示(genbank登錄號jn940819第310-378位)，當目標菌株為colletotrichumcliviaecgmcc3.17358時，上述靶序列的核苷酸序列如seqidno.5所示。
第二方面，本發明提供所述的靶序列在鑑定刺盤孢屬真菌中的應用。上述靶序列在鑑定刺盤孢屬真菌中的應用為通過檢測待測樣本中是否含有所述靶序列，判斷待測樣本中是否含有刺盤孢屬真菌或是否為刺盤孢屬真菌。優選地，所述應用包括：檢測待測樣本的總dna中是否含有所述靶序列；如果含有所述靶序列，則待測樣本含有或疑似含有刺盤孢屬真菌，或者，是或疑似是刺盤孢屬真菌；如果不含有所述靶序列，則待測樣本不含有或疑似不含有刺盤孢屬真菌，或者不是或疑似不是刺盤孢屬真菌。第三方面，本發明提供鑑定刺盤孢屬真菌的特異性引物對，包括序列如seqidno.1所示的正向引物和序列如seqidno.2所示的反向引物。上述特異性引物對與刺盤孢屬靶序列具有高度的結合特異性和優異的擴增效率，能夠保證pcr檢測的特異性、靈敏度和準確性。上述特異性引物可以單獨使用進行pcr檢測，或者與特異性探針配合使用，進行熒光定量pcr檢測。具體序列如下：正向引物(clf)：seqidno.1：5'-agagggttaaacagcacgtgaaa-3'；反向引物(clr)：seqidno.2：5'-gattcaccggacgcaagtct-3'。
第四方面，本發明提供含有所述鑑定刺盤孢屬真菌的特異性引物對(seqidno.1-2所示)和序列如seqidno.3所示的探針的引物探針組合。上述特異性探針能夠更好地與所述特異性引物對配合，進一步提高熒光pcr擴增的擴增效率，更好地保證熒光定量pcr檢測的特異性、靈敏度和準確性。為滿足熒光檢測的需要，所述探針的一個末端標記有熒光報告基團，另一個末端標記有熒光淬滅基團。優選地，所述探針的5'末端標記有熒光報告基團，3'末端標記有熒光淬滅基團。作為本發明的一種實施方式，所述探針的5'端標記熒光報告基團fam，3'端標記熒光淬滅基團mgb。具體序列如下：探針(clp)：seqidno.3：5'-fam-tgttaaaagggaagcgctt-mgb-3'。
上述探針clp在完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；在進行刺盤孢屬鑑定的pcr擴增時，taqdna聚合酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，發出熒光信號，從而使熒光信號的累積與pcr產物形成完全同步，可進行pcr產物形成的高效檢測。本發明提供的上述靶序列、特異性引物對、引物探針組合能夠普遍適用於多種刺盤孢屬真菌的鑑定。第五方面，本發明提供所述特異性引物對或所述引物探針組合在製備鑑定刺盤孢屬真菌的試劑盒或鑑定刺盤孢屬真菌中的應用。本發明中，所述鑑定刺盤孢屬真菌包括鑑定待測菌是否為刺盤孢屬真菌或鑑定待測樣品中是否含有刺盤孢屬真菌。優選地，所述特異性引物對或所述引物探針組合的應用包括如下任意一種：(1)鑑定刺盤孢屬真菌；(2)製備用於鑑定刺盤孢屬真菌的試劑盒；(3)檢測待測樣本是否含有刺盤孢屬真菌；(4)製備用於檢測待測樣本是否含有刺盤孢屬真菌的試劑盒。第六方面，本發明提供一種鑑定刺盤孢屬真菌的試劑盒，包含所述特異性引物對或所述引物探針組合。
優選地，所述試劑盒還包括dntps、pcr反應緩衝液、mg2+、dna聚合酶、陽性模板中的一種或多種。上述dntps、pcr反應緩衝液、mg2+、dna聚合酶各組分可以單獨包裝，或製備為預混液。所述預混液可製備為不同的濃度，如2×pcr預混液。所述預混液可以將包括dntps、pcr反應緩衝液、mg2+、dna聚合酶的pcr擴增組分混合製備或採用商品化的pcr預混液，例如abi公司的2×universalpcrmastermix。本發明還提供上述試劑盒的如下任意一種應用：(1)鑑定待測樣本是否為刺盤孢屬真菌；(2)鑑定待測樣本是否含有刺盤孢屬真菌。
第七方面，本發明提供一種鑑定刺盤孢屬真菌的方法，以待測樣品的dna為模板，利用所述特異性引物對或所述引物探針組合進行pcr擴增，根據擴增產物判斷所述待測樣品是否為刺盤孢屬真菌或所述待測樣品是否含有刺盤孢屬真菌。作為本發明的一種實施方式，以待測樣本的dna為模板，利用所述特異性引物對進行pcr擴增，檢測pcr擴增產物；如果檢測到特異性擴增產物，則待測樣本為/候選為刺盤孢屬真菌，或者，含有/疑似含有刺盤孢屬真菌；如果未檢測到特異性擴增產物，則待測樣本不是/疑似不是刺盤孢屬真菌，或者，不含/疑似不含刺盤孢屬真菌。作為本發明的另一種實施方式，以待測樣本的dna為模板，利用所述引物探針組合進行實時熒光pcr擴增，檢測熒光信號，如果熒光信號顯示符合陽性擴增曲線，則待測樣本為或候選為刺盤孢屬真菌，或者，含有或疑似含有刺盤孢屬真菌；如果熒光信號顯示不符合陽性擴增曲線，則待測樣本不是/疑似不是刺盤孢屬真菌，或者，不含/疑似不含刺盤孢屬真菌。以上任一所述特異擴增產物可為69bp的擴增產物。優選地，所述pcr擴增的反應體系中，所述特異性引物對的濃度為0.4～0.9μm，所述探針的濃度為0.3～0.9μm。採用上述引物和探針的濃度，能夠更好地提高pcr擴增反應的擴增效率，進而提高檢測的特異性、靈敏度和準確性。優選地，所述實時熒光pcr的反應條件為：95℃反應10min，1個循環；95℃反應15s，60℃反應1min，40個循環。本發明中，所述待測樣本可為植物樣品、真菌純培養樣品、土壤樣品等。
優選地，所述植物樣本具體可為葉片、莖稈、根、果實等。本發明進一步優化了實時熒光pcr的反應體系，獲得了最優的引物濃度和探針濃度。本發明針對現有技術中依賴形態學檢測和測序對刺盤孢屬真菌進行鑑定的方法存在的技術問題(費時、繁瑣、專業性要求高等缺點)，根據刺盤孢屬物種的遺傳學和分子生物學特徵，開發了刺盤孢屬保守的、屬特異性靶序列以及其特異性引物對和探針，利用開發的特異性引物對和探針對刺盤孢屬真菌進行檢測鑑定，進而提供了一種操作簡單、快速、靈敏、準確的鑑定刺盤孢屬真菌的方法。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：(1)高普適性：對比現有技術適於特定的一種刺盤孢屬真菌，本發明對多種刺盤孢屬真菌具有高度的普適性，包括如表1所示的50餘種重要的刺盤孢真菌(colletotrichum＝c.)；表1本發明適用的刺盤孢屬真菌(2)檢測過程快速簡單：本發明提供的檢測方法僅需少量dna樣品，利用熒光pcr儀僅需1小時就可完成pcr擴增，直接得到檢測結果；(3)特異性強：本發明提供的針對刺盤孢屬真菌的特異性引物對具有高度的屬特異性，能夠高效進行目標基因片段的擴增，可與本發明提供的特異性熒光探針配合進行檢測，有效地避免假陽性和假陰性；(4)靈敏度高：本發明提供的針對刺盤孢屬真菌的特異性引物對具有優異的擴增效率，與本發明提供的特異性熒光探針配合，能夠顯著提高檢測的靈敏度；(5)交叉污染低：本發明提供的熒光定量pcr檢測方法的整個檢測過程完全閉管，不需pcr後處理，消除了pcr產物的污染；(6)本發明提供的熒光定量pcr檢測方法可以實現刺盤孢屬真菌的定量檢測。本發明提供的靶序列、特異性引物對和探針以及檢測方法，在檢疫口岸，能夠對含有刺盤孢屬真菌的樣品進行快速準確篩查，防止病菌隨種子及其它繁殖材料進出口、調運而傳播蔓延，對於植物病原性刺盤孢屬真菌的檢測、防控以及促進農業生產的健康發展具有重要的意義，具有重大的應用推廣價值。附圖說明圖1為實施例2中不同引物濃度的擴增曲線對比圖，其中，編號1～10分別為實驗組1～10，編號0為空白對照組。圖2為實施例3中不同探針濃度的擴增曲線對比圖，其中，編號1～10分別為實驗組1～10，編號0為空白對照組。圖3為實施例4中實時熒光pcr檢測刺盤孢屬真菌的特異性分析結果圖。
圖4為實施例5中用於靈敏度分析的不同模板dna含量的擴增曲線對比圖，其中，編號1～6分別為實驗組1～6(3個重複)的擴增曲線。圖5為實施例5中dna模板濃度與熒光定量檢測的ct值呈負相關結果圖。具體實施方式下面將結合實施例對本發明的優選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，並不是用於對本發明的範圍進行限制。本領域的技術人員在不背離本發明的宗旨和精神的情況下，可以對本發明進行各種修改和替換。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。以下實施例中所有涉及的菌株，均可以從商業途徑或保藏機構獲得。實施例1鑑定刺盤孢屬真菌的靶序列、特異性引物和探針的篩選和確定從ncbi數據庫獲取刺盤孢屬、同科不同屬以及其它常見真菌(如：diaporthe、curvularia、fusarium等，見表2)的28srdna、its、gapdh等序列，結合申請人測序得到的刺盤孢屬真菌以及其它真菌的大量序列，進行序列比對和分析，尋找在多種不同的刺盤孢屬真菌中具有高度保守性、同時在與刺盤孢屬親緣關係較近的其它屬真菌存在明顯差異的序列，經篩選，確定普遍適用於刺盤孢屬真菌鑑定的且具有屬特異性的靶序列，其位於28srdna上，對應genbank登錄號jn940819第310-378位的位置，當目標菌株為c.truncatumcbs151.35時，上述靶序列的核苷酸序列如seqidno.4所示，當目標菌株為c.cliviaecgmcc3.17358時，上述靶序列的核苷酸序列如seqidno.5所示。針對該保守區域設計多條特異性引物和探針，篩選並確定具有優異的靶序列結合和擴增效率、高度特異性和靈敏度的特異性引物和探針。
引物和探針設計採用軟件設計輔助人工優化和篩選，本發明經過大量實驗發現經引物設計軟件設計、並打分較高的引物和探針或根據常規的引物、探針設計原則設計的引物和探針並不能完全滿足本發明對於鑑定引物的刺盤孢屬真菌通用性和特異性的要求，很多軟件設計或根據常規的引物探針設計原則設計的引物和探針僅在部分刺盤孢屬真菌中具有較好的擴增效果，但在其它刺盤孢屬真菌中擴增效果不佳。因此，本發明根據不同刺盤孢屬真菌的基因序列，進行了人工優化設計和大量引物探針組合的篩選對比，最終確定了如seqidno.1-2所示的特異性引物對和如seqidno.3所示的探針的最佳引物探針組合。實施例2不同引物濃度對鑑定結果的影響本實施例的目的在於分析反應體系中不同引物濃度對刺盤孢屬真菌鑑定結果的影響，以獲得鑑定時採用的最優引物濃度。
(1)待測菌dna製備：將咖啡漿果刺盤孢imi319418的基因組dna進行梯度稀釋後作為熒光定量pcr擴增的模板。
(2)用於檢測刺盤孢屬真菌的引物探針組：正向引物clf：5'-agagggttaaacagcacgtgaaa-3'(seqidno.1)；反向引物clr：5'-gattcaccggacgcaagtct-3'(seqidno.2)；探針clp：5'-fam-tgttaaaagggaagcgctt-mgb-3'(seqidno.3)，探針5'端含有fam報告熒光染料，3'端含有不發熒光的淬滅基團並具有mgb分子。
(3)用於檢測刺盤孢屬真菌的pcr反應體系：反應體系(10μl)：5μl2×universalpcrmastermix，xμl引物clf(10μmol/l)，xμl引物clr(10μmol/l)，0.5μl探針clp(10μmol/l)，1μl模板，用滅菌雙蒸水補至10μl。反應體系中，探針clp終濃度為0.5μmol/l；建立不同的實驗組，各實驗組以反應體系中引物濃度作為變量，其餘組分的濃度和實驗條件均相同：實驗組1中，x為0.1，引物clf終濃度為0.1μmol/l，引物clr終濃度為0.1μmol/l；實驗組2中，x為0.2，引物clf終濃度為0.2μmol/l，引物clr終濃度為0.2μmol/l；實驗組3中，x為0.3，引物clf終濃度為0.3μmol/l，引物clr終濃度為0.3μmol/l；實驗組4中，x為0.4，引物clf終濃度為0.4μmol/l，引物clr終濃度為0.4μmol/l；實驗組5中，x為0.5，引物clf終濃度為0.5μmol/l，引物clr終濃度為0.5μmol/l；實驗組6中，x為0.6，引物clf終濃度為0.6μmol/l，引物clr終濃度為0.6μmol/l；實驗組7中，x為0.7，引物clf終濃度為0.7μmol/l，引物clr終濃度為0.7μmol/l；實驗組8中，x為0.8，引物clf終濃度為0.8μmol/l，引物clr終濃度為0.8μmol/l；實驗組9中，x為0.9，引物clf終濃度為0.9μmol/l，引物clr終濃度為0.9μmol/l；實驗組10中，x為1.0，引物clf終濃度為1.0μmol/l，引物clr終濃度為1.0μmol/l；空白對照組：用等體積水代替模板，作為空白對照。(4)用於檢測刺盤孢屬真菌的實時熒光pcr反應條件：依次95℃反應10min，1個循環；95℃反應15s，60℃反應1min，40個循環。
實驗結果如圖1所示，實驗組1～10均能檢測到陽性擴增曲線；其中，實驗組3～10的陽性擴增曲線的形狀和趨勢較好，表明pcr反應體系中正向引物和反向引物的濃度為0.3～1.0μmol/l的pcr擴增效率較高，適於刺盤孢屬真菌的鑑定。實施例3不同探針濃度對鑑定結果的影響(1)待測菌dna製備：將咖啡漿果刺盤孢imi319418的基因組dna進行梯度稀釋後作為熒光定量pcr的模板。(2)用於檢測刺盤孢屬真菌的引物探針組：正向引物clf：5'-agagggttaaacagcacgtgaaa-3'(seqidno.1)；反向引物clr：5'-gattcaccggacgcaagtct-3'(seqidno.2)；探針clp：5'-fam-tgttaaaagggaagcgctt-mgb-3'(seqidno.3)，探針5'端含有fam報告熒光染料，3'端含有不發熒光的淬滅基團並具有mgb分子。(3)用於檢測刺盤孢屬的pcr反應體系：反應體系(10μl)：5μl2×universalpcrmastermix，0.7μl引物clf(10μmol/l)，0.7μl引物clr(10μmol/l)，yμl探針clp(10μmol/l)，1μl模板，用滅菌雙蒸水補至10μl。反應體系中，引物clf終濃度為0.7μmol/l，引物clr終濃度為0.7μmol/l；建立不同的實驗組，各實驗組以反應體系中探針濃度作為變量，其餘組分的濃度和實驗條件均相同：實驗組1中，y為0.1，探針clp終濃度為0.1μmol/l；實驗組2中，y為0.2，探針clp終濃度為0.2μmol/l；實驗組3中，y為0.3，探針clp終濃度為0.3μmol/l；實驗組4中，y為0.4，探針clp終濃度為0.4μmol/l；實驗組5中，y為0.5，探針clp終濃度為0.5μmol/l；實驗組6中，y為0.6，探針clp終濃度為0.6μmol/l；實驗組7中，y為0.7，探針clp濃度為0.7μmol/l；實驗組8中，y為0.8，探針clp終濃度為0.8μmol/l；實驗組9中，y為0.9，探針clp終濃度為0.9μmol/l；實驗組10中，y為1.0，探針clp終濃度為1.0μmol/l；空白對照組：用等體積水代替模板，作為空白對照。
(4)用於檢測刺盤孢屬的實時熒光pcr反應條件：依次95℃反應10min，1個循環；95℃反應15s，60℃反應1min，40個循環。實驗結果如圖2所示，實驗組1～10均能顯示出陽性擴增曲線；其中實驗組3～9的陽性擴增曲線的形狀和趨勢較好，表明pcr反應體系中探針濃度為0.3～0.9μmol/l的pcr擴增效率較高，適於刺盤孢屬真菌的鑑定。實施例4實時熒光pcr檢測刺盤孢屬真菌的特異性本實施例利用實施例1確定的特異性引物和探針以及實施例2和3確定的反應體系，檢測不同的刺盤孢屬真菌，分析檢測的特異性。本實施例的檢測對象為如表1所示的51種刺盤孢屬真菌和28種非刺盤孢屬微生物，其中，菌株編號以cbs開頭的菌株來源於荷蘭westerdijk菌種保藏中心，cgmcc菌株來源於中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，bcc菌株來源於泰國微生物菌種保藏中心，imi菌株的dna來源於英國微生物菌種保藏中心，lc菌株為發明人分離鑑定，保藏於中國科學院微生物研究所真菌學國家重點實驗室蔡磊課題組(http://www.mycolab.org.cn/templates/t_second/index.aspx？nodeid＝554)。表2用于特异性检测的刺盘孢属和非刺盘孢属真菌的菌株信息(1)待測菌dna的準備：提取表1中51種刺盤孢屬真菌和28種非刺盤孢屬微生物的基因組dna，將基因組dna分別稀釋後作為熒光定量pcr擴增的待測菌dna模板。
(2)用於檢測刺盤孢屬的引物探針組：正向引物clf：5'-agagggttaaacagcacgtgaaa-3'(seqidno.1)；反向引物clr：5'-gattcaccggacgcaagtct-3'(seqidno.2)；探針clp：5'-fam-tgttaaaagggaagcgctt-mgb-3'(seqidno.3)，探針5'端含有fam報告熒光染料，3'端含有不發熒光的淬滅基團並具有mgb分子。(3)用於檢測刺盤孢屬的pcr反應體系：反應體系(10μl)：5μl2×universalpcrmastermix，0.5μl引物clf(10μmol/l)，0.5μl引物clr(10μmol/l)，0.5μl探針clp(10μmol/l)，1μl模板，用滅菌雙蒸水補至10μl。反應體系中，引物clf終濃度為0.5μmol/l，引物clr終濃度為0.5μmol/l，探針clp終濃度為0.5μmol/l。用等體積水代替模板，作為空白對照。(4)用於檢測刺盤孢屬的實時熒光pcr反應條件：依次95℃反應10min，1個循環；95℃反應15s，60℃反應1min，40個循環。實驗結果顯示，51種刺盤孢屬真菌的熒光信號均顯示符合陽性擴增曲線，刺盤孢屬以外的待測菌均無法擴增，說明實施例1提供的最佳引物探針組合(seqidno.1-3)具有良好的特異性，僅能檢出刺盤孢屬真菌。部分待測菌的擴增結果如圖3所示。實施例5實時熒光pcr檢測刺盤孢屬真菌的靈敏度(1)待測菌dna製備：將colletotrichumjasmini-sambaccbs130420的基因組dna進行梯度稀釋後作為模板。(2)用於檢測刺盤孢屬真菌的引物探針組：正向引物clf：5'-agagggttaaacagcacgtgaaa-3'(seqidno.1)；反向引物clr：5'-gattcaccggacgcaagtct-3'(seqidno.2)；探針clp：5'-fam-tgttaaaagggaagcgctt-mgb-3'(seqidno.3)，探針5'端含有fam報告熒光染料，3'端含有不發熒光的淬滅基團並具有mgb分子。(3)用於檢測刺盤孢屬真菌的pcr反應體系：反應體系(10μl)：5μl2×universalpcrmastermix，0.7μl引物clf(10μmol/l)，0.7μl引物clr(10μmol/l)，0.5μl探針clp(10μmol/l)，1μl模板，用滅菌雙蒸水補至10μl。
反應體系中，引物clf終濃度為0.7μmol/l，引物clr終濃度為0.7μmol/l，探針clp終濃度為0.5μmol/l；建立不同的實驗組，各實驗組以模板中的dna含量作為變量，其餘組分和條件均相同：實驗組1中，模板的dna含量為68ng；實驗組2中，模板的dna含量為6.8ng；實驗組3中，模板的dna含量為680pg；實驗組4中，模板的dna含量為68pg；實驗組5中，模板的dna含量為6.8pg；實驗組6中，模板的dna含量為680fg；實驗組7中，模板的dna含量為68fg；實驗組8中，模板的dna含量為6.8fg；空白對照組：用等體積水代替模板，作為空白對照。
(4)用於檢測刺盤孢屬真菌的實時熒光pcr反應條件：依次95℃反應10min，1個循環；95℃反應15s，60℃反應1min，40個循環。實驗結果如圖4和圖5所示。實驗組1～8及空白對照組的3次重複實驗的擴增曲線對比圖如圖4所示，結果表明，實驗組1～6均顯示陽性擴增曲線，即最低檢測限為680fg模板dna/體系。dna模板濃度與ct值的相關性如圖5所示，可見模板濃度越高，ct值越小。實施例6實時熒光pcr檢測樣品中是否含有刺盤孢屬真菌本實施例提供本發明提供的鑑定刺盤孢屬真菌的特異性引物和探針以及檢測方法在鑑定刺盤孢屬真菌中的應用。(1)待測菌dna製備：模擬環境樣品，分別製備樣品1和樣品2樣品1：分別取如表3所示的28個菌株的dna樣品1μl放至1個新的離心管中，混勻，模擬環境樣品的總dna。然後從中取1μldna作為待檢對象。用咖啡漿果刺盤孢imi319418的dna作為陽性對照，chordomycesantarcticuscbs120045作為陰性對照，無菌水代替模板作為空白對照。表3模擬環境微生物混合菌群的真菌物種信息序號菌株編號物種序號菌株編號物種
1cbs120045chordomycesantarcticus15lc0185curvulariaalcornii2cbs428.76cylindrotrichumclavatum16lc0744diaporthelithocarpus3cbs421.95kylindriaperuamazonensis17lc6150diaporthepseudophoenicicola4cbs346.76monilochaetesguadalcanalensis18cgmcc3.17536diaporthecompacta5cbs968.72musicilliumtheobromae19lc6154diaportheunshiuensis6cbs113362plectosphaerellaalismatis20cbs525.77didymellapinodes7cbs139623plectosphaerellapopuli21lc11639fusariumincarnatum8cbs125296reticulascusclavatus22lc11735leptosphaeriaspegazzinii9cbs101319reticulascustulasneorum23lc11508penicilliumchrysogenum10cbs110278sodiomycesalkalinus24cbs134.96phomadelphinii11cbs137618sodiomycestronii25lc1636phomasegeticola12cbs136360sporoschismopsisangustata26cbs111645phyllostictaparthenocissi13cbs121802stachylidiumbicolor27cbs502.50septorialinicola14lc0224cercosporagossypi28lc11567verticilliumdahliae表3中cbs菌株來源於荷蘭westerdijk菌種保藏中心，cgmcc菌株來源於中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，lc菌株為發明人分離鑑定，保藏於中國科學院微生物研究所蔡磊課題組(http://www.mycolab.org.cn/templates/t_second/index.aspx？nodeid＝554)。样品2：将10μl样品1(混合的28个菌株的dna样品)转移至新的离心管中，然后加入随机挑选的如表4所示的15个刺盘孢属真菌的dna样品(每个刺盘孢属菌株的dna取1μl)，混匀，从中取1μl作为待检对象。用咖啡浆果刺盘孢imi319418的dna作为阳性对照，chordomycesantarcticuscbs120045作为阴性对照，无菌水代替模板作为空白对照。
表4實施例6中用於檢測的15個刺盤孢屬真菌序號菌株編號刺盤孢屬物種序號菌株編號刺盤孢屬物種1lc3649c.acutatum9imi319418c.kahawaesubsp.kahawae2cgmcc3.14356c.boninense10cbs523.97c.lindemuthianum3cgmcc3.18118c.camelliae-japonicae11cbs132882c.proteae4cgmcc3.15106c.caudasporum12cgmcc3.14174c.siamense5lc3659c.dematium13lc6284c.truncatum6cbs147945c.falcatum14cbs125478c.vietnamense7cbs130416c.fructicola15cbs132135c.yunnanense8cbs953.97c.gloeosporioides表4中cbs菌株來源於荷蘭westerdijk菌種保藏中心，imi菌株的dna來源於英國微生物菌種保藏中心，lc菌株為發明人分離鑑定，保藏於中國科學院微生物研究所蔡磊課題組
反應體系中，引物clf終濃度為0.7μmol/l，引物clr終濃度為0.7μmol/l，探針clp終濃度為0.5μmol/l。用等體積水代替模板作為空白對照。(4)用於檢測刺盤孢屬的實時熒光pcr反應條件：依次95℃反應10min，1個循環；95℃反應15s，60℃反應1min，40個循環。實驗結果表明，陽性對照以及含有刺盤孢屬真菌dna的樣品2能夠檢測到陽性擴增曲線，陰性對照、空白對照以及不含有刺盤孢屬dna的樣品1未檢測到陽性擴增曲線。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。序列表<110>中國科學院微生物研究所<120>刺盤孢屬特異性引物篩查檢疫鑑定方法<130>khp191111415.4<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1agagggttaaacagcacgtgaaa23<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence400>2gattcaccggacgcaagtct20<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tgttaaaagggaagcgctt19<210>4<211>69<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4agagggttaaacagcacgtgaaattgttaaaagggaagcgcttgtgaccagacttgcgtc60cggtgaatc69<210>5<211>69<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5agagggttaaacagcacgtgaaattgttaaaagggaagcgcttgtgaccagacttgcgcc60cggtgaatc69當前第1頁12
目錄
參考文獻
- ↑ 刺盤孢屬及其近似屬的五個中國新記錄種, 豆丁 , 2013-09-24