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'''双光子激发显微镜'''（英语：Two-photon excitation microscopy）是一种荧光成像[[技术]]，可以对活体组织进行深度约1毫米的成像。它不同于传统的荧光显微镜，其中激发波长短于发射波长，因为两个激发光子的波长长于所得发射光的波长。 双光子激发显微术通常使用近红外激发光，其也可以激发荧光染料。然而，对于每次激发，两个光子的红外光被吸收。使用[[红外线]]可最大限度地减少组织中的散射。由于多光子吸收，背景信号被强烈抑制。这两种效果都会导致这些[[显微镜]]的穿透深度增加。 由于其更深的组织穿透，有效的光检测和减少的光漂白，双光子激发可以是共聚焦显微镜的优越替代品。 | '''双光子激发显微镜'''（英语：Two-photon excitation microscopy）是一种荧光成像[[技术]]，可以对活体组织进行深度约1毫米的成像。它不同于传统的荧光显微镜，其中激发波长短于发射波长，因为两个激发光子的波长长于所得发射光的波长。 双光子激发显微术通常使用近红外激发光，其也可以激发荧光染料。然而，对于每次激发，两个光子的红外光被吸收。使用[[红外线]]可最大限度地减少组织中的散射。由于多光子吸收，背景信号被强烈抑制。这两种效果都会导致这些[[显微镜]]的穿透深度增加。 由于其更深的组织穿透，有效的光检测和减少的光漂白，双光子激发可以是共聚焦显微镜的优越替代品。 | ||
借助于强聚焦激光束，产生非线性[[光学]]效应，其基于同时到达一个分子中的若干光子（光粒子）的相互作用。 因此，所产生的信号的强度不会随着照射[[光子]]的数量而线性增加，而是与平方率（对于双光子效应）或立方率（对于三光子效应）一致。 | 借助于强聚焦激光束，产生非线性[[光学]]效应，其基于同时到达一个分子中的若干光子（光粒子）的相互作用。 因此，所产生的信号的强度不会随着照射[[光子]]的数量而线性增加，而是与平方率（对于双光子效应）或立方率（对于三光子效应）一致。 | ||
| − | 多光子显微镜的操作类似于[[激光扫描共聚焦显微镜|共聚焦激光扫描显微镜]]的操作。 然而，虽然共聚焦激光扫描显微具有50-80 μm的穿透深度，取决于制剂，可以与多光子显微镜一起使用更深的区域，例如，200 μm，在非常有利的情况下甚至可达到1000 μm（= 1 mm）。 活体组织的这一图像可能是用其它方法无法成像。 | + | 多光子显微镜的操作类似于[[激光扫描共聚焦显微镜|共聚焦激光扫描显微镜]]<ref>[https://www.sohu.com/a/403805446_680608 【科研方法】激光扫描共聚焦显微镜技术使用指南]，搜狐，2020-06-24 </ref> 的操作。 然而，虽然共聚焦激光扫描显微具有50-80 μm的穿透深度，取决于制剂，可以与多光子显微镜一起使用更深的区域，例如，200 μm，在非常有利的情况下甚至可达到1000 μm（= 1 mm）。 活体组织的这一图像可能是用其它方法无法成像。 |
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| − | 双光子显微镜由温弗里德·登克(Winfried Denk)和James Strickler于1990年在[[康奈尔大学]]的瓦·韦伯(Watt W. Webb)实验室开创并获得[[专利]]。他们将双光子吸收的概念与使用激光扫描仪相结合。在双光子激发显微镜中，红外激光束通过物镜聚焦。 通常使用的钛-蓝宝石激发激光具有大约100飞秒的脉冲宽度和大约80MHz的重复率，允许两个光子吸收所需的高光子密度和通量，并且可以在宽波长范围内调节。 具有325fs脉冲的锁模的Yb掺杂[[光纤激光器]]也已用于胶原成像，证明[[胶原蛋白]]的穿透深度超过320μm，这相当于当耦合到传统钛-[[蓝宝石]]激发激光时可实现的250-300 μm的深度。 | + | 双光子显微镜由温弗里德·登克(Winfried Denk)和James Strickler于1990年在[[康奈尔大学]]的瓦·韦伯(Watt W. Webb)实验室开创并获得[[专利]]<ref>[https://www.sohu.com/a/239429211_650136 程和平院士专访 | 自主研发微型化双光子显微镜 ]，搜狐，2018-07-05</ref> 。他们将双光子吸收的概念与使用激光扫描仪相结合。在双光子激发显微镜中，红外激光束通过物镜聚焦。 通常使用的钛-蓝宝石激发激光具有大约100飞秒的脉冲宽度和大约80MHz的重复率，允许两个光子吸收所需的高光子密度和通量，并且可以在宽波长范围内调节。 具有325fs脉冲的锁模的Yb掺杂[[光纤激光器]]也已用于胶原成像，证明[[胶原蛋白]]的穿透深度超过320μm，这相当于当耦合到传统钛-[[蓝宝石]]激发激光时可实现的250-300 μm的深度。 |
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於 2020年8月16日 (日) 20:09 的最新修訂
雙光子激發顯微鏡（英語：Two-photon excitation microscopy）是一種熒光成像技術，可以對活體組織進行深度約1毫米的成像。它不同於傳統的熒光顯微鏡，其中激發波長短於發射波長，因為兩個激發光子的波長長於所得發射光的波長。 雙光子激發顯微術通常使用近紅外激發光，其也可以激發熒光染料。然而，對於每次激發，兩個光子的紅外光被吸收。使用紅外線可最大限度地減少組織中的散射。由於多光子吸收，背景信號被強烈抑制。這兩種效果都會導致這些顯微鏡的穿透深度增加。 由於其更深的組織穿透，有效的光檢測和減少的光漂白，雙光子激發可以是共聚焦顯微鏡的優越替代品。
藉助於強聚焦激光束，產生非線性光學效應，其基於同時到達一個分子中的若干光子（光粒子）的相互作用。 因此，所產生的信號的強度不會隨着照射光子的數量而線性增加，而是與平方率（對於雙光子效應）或立方率（對於三光子效應）一致。
多光子顯微鏡的操作類似於共聚焦激光掃描顯微鏡[1]的操作。 然而，雖然共聚焦激光掃描顯微具有50-80 μm的穿透深度，取決於製劑，可以與多光子顯微鏡一起使用更深的區域，例如，200 μm，在非常有利的情況下甚至可達到1000 μm（= 1 mm）。 活體組織的這一圖像可能是用其它方法無法成像。
概念
雙光子激發採用雙光子吸收，這一概念首先由瑪麗亞·格佩特-梅耶（1906-1972年）在1931年的博士論文中描述，並且首次在1961年被Wolfgang凱撒（Wolfgang Kaiser (physicist)）使用激光激發在CaF2：Eu2 +晶體中觀察到。 艾薩克·阿貝拉（Isaac Abella）於1962年在銫蒸氣中表明，雙光子激發單個原子是可能的。
雙光子激發熒光顯微鏡與共聚焦激光掃描顯微鏡具有相似性。
開發
雙光子顯微鏡由溫弗里德·登克(Winfried Denk)和James Strickler於1990年在康奈爾大學的瓦·韋伯(Watt W. Webb)實驗室開創並獲得專利[2]。他們將雙光子吸收的概念與使用激光掃描儀相結合。在雙光子激發顯微鏡中，紅外激光束通過物鏡聚焦。 通常使用的鈦-藍寶石激發激光具有大約100飛秒的脈衝寬度和大約80MHz的重複率，允許兩個光子吸收所需的高光子密度和通量，並且可以在寬波長範圍內調節。 具有325fs脈衝的鎖模的Yb摻雜光纖激光器也已用於膠原成像，證明膠原蛋白的穿透深度超過320μm，這相當於當耦合到傳統鈦-藍寶石激發激光時可實現的250-300 μm的深度。
視頻
雙光子激發顯微鏡 相關視頻
參考文獻
- ↑ 【科研方法】激光掃描共聚焦顯微鏡技術使用指南，搜狐，2020-06-24
- ↑ 程和平院士專訪 | 自主研發微型化雙光子顯微鏡 ，搜狐，2018-07-05