雙光子激發顯微鏡

雙光子激發顯微鏡原圖鏈接來自 中國科學院生物物理研究所 的圖片

雙光子激發顯微鏡（英語：Two-photon excitation microscopy）是一種熒光成像技術，可以對活體組織進行深度約1毫米的成像。它不同於傳統的熒光顯微鏡，其中激發波長短於發射波長，因為兩個激發光子的波長長於所得發射光的波長。 雙光子激發顯微術通常使用近紅外激發光，其也可以激發熒光染料。然而，對於每次激發，兩個光子的紅外光被吸收。使用紅外線可最大限度地減少組織中的散射。由於多光子吸收，背景信號被強烈抑制。這兩種效果都會導致這些顯微鏡的穿透深度增加。 由於其更深的組織穿透，有效的光檢測和減少的光漂白，雙光子激發可以是共聚焦顯微鏡的優越替代品。

藉助於強聚焦激光束，產生非線性光學效應，其基於同時到達一個分子中的若干光子（光粒子）的相互作用。 因此，所產生的信號的強度不會隨着照射光子的數量而線性增加，而是與平方率（對於雙光子效應）或立方率（對於三光子效應）一致。

多光子顯微鏡的操作類似於共聚焦激光掃描顯微鏡的操作。 然而，雖然共聚焦激光掃描顯微具有50-80 μm的穿透深度，取決於製劑，可以與多光子顯微鏡一起使用更深的區域，例如，200 μm，在非常有利的情況下甚至可達到1000 μm（= 1 mm）。 活體組織的這一圖像可能是用其它方法無法成像。

目錄

概念

雙光子激發採用雙光子吸收，這一概念首先由瑪麗亞·格佩特-梅耶（1906-1972年）在1931年的博士論文中描述，並且首次在1961年被Wolfgang凱撒（Wolfgang Kaiser (physicist)）使用激光激發在CaF2：Eu2 +晶體中觀察到。 艾薩克·阿貝拉（Isaac Abella）於1962年在銫蒸氣中表明，雙光子激發單個原子是可能的。

雙光子激發熒光顯微鏡與共聚焦激光掃描顯微鏡具有相似性。

開發

雙光子顯微鏡由溫弗里德·登克(Winfried Denk)和James Strickler於1990年在康奈爾大學的瓦·韋伯(Watt W. Webb)實驗室開創並獲得專利。他們將雙光子吸收的概念與使用激光掃描儀相結合。在雙光子激發顯微鏡中，紅外激光束通過物鏡聚焦。 通常使用的鈦-藍寶石激發激光具有大約100飛秒的脈衝寬度和大約80MHz的重複率，允許兩個光子吸收所需的高光子密度和通量，並且可以在寬波長範圍內調節。 具有325fs脈衝的鎖模的Yb摻雜光纖激光器也已用於膠原成像，證明膠原蛋白的穿透深度超過320μm，這相當於當耦合到傳統鈦-藍寶石激發激光時可實現的250-300 μm的深度。

視頻

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