密度梯度離心法
| 密度梯度離心法 |
密度梯度離心法: 液體在離心時，其密度隨轉軸距離而增加。鹼基GC 配對的雙鏈DNA 片段密度較大，利用精密的密度梯度超離心技術可使切割適當片段的不同DNA 按密度大小分布開來。進而通過與某种放射性標記的mRNA 雜交來檢驗，分離相應的基因。非洲爪蟾rDNA.5sDNA 和海膽組蛋白基因就是這樣分離得到的。密度梯度超離心技術不僅可以分離細胞中的DNA,也可以利用它分離到生物細胞中的某些目的基因的mRNA。一般細胞含mRNA 並不豐富，大多數細胞mRNA 只占總RNA 百分之幾，mRNA 種類又非常多，各種mRNA 鏈長短不一，總mRNA 提取出來後，提取到鋪在已預製了不同密度層次溶液介質的離心管中，人們可以利用密度梯度超離心技術將大小不同的mRNA 分離在不同密度層次上，然後可以根據所需的mRNA 的大小，在相應層次上提取。
密度梯度區帶離心法(簡稱區帶離心法)，是將樣品加在惰性梯度介質中進行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區帶的分離方法。此法的優點是:①分離效果好，可一次獲得較純顆粒;②適應範圍廣，能像差速離心法一樣分離具有沉降係數差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒;③顆粒不會擠壓變形，能保持顆粒活性，並防止已形成的區帶由於對流而引起混合。此法的缺點是:①離心時間較長;②需要製備惰性梯度介質溶液;③操作嚴格，不易掌握。
目錄
基本信息
中文名稱； 密度梯度離心法
外文名稱； density gradient centrifugation method
簡稱； 區帶離心法
又稱； 平衡密度梯度離心法
屬性； 分離方法
密度梯度離心法
英文名稱: density gradient centrifugation method
〔1〕亦稱平衡密度梯度離心法。用超離心機對小分子物質溶液，長時間加一個離心力場達到沉降平衡，在沉降池內從液面到底部出現一定的密度梯度。若在該溶液里加入少量大分子溶液，則溶液內比溶劑密度大的部分就產生大分子沉降，比溶劑密度小的部分就會上浮，最後在離心力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子帶狀物。利用這種現象，測定核酸或蛋白質等的浮游密度，或根據其差別進行分析的一種沉降平衡法。自1958年米西爾遜(M.Meselson)，斯塔爾(F.W.Stahl)，維諾格拉德(J.Vinograd)成功地分離了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以來，該法取得許多成果。為得到必要的濃度梯度，多採用濃氯化銫溶液，所以有時也使用氯化銫濃度梯度離心法這個名稱，還可採用氯化銣、溴化銫等溶液。通常利用分析超離心機，但在將細胞顆粒成分進行分離等以純化為目的的情況，利用密度差，使用分離超離心機，採用預先製備好的蔗糖等的密度梯度。〔2〕採用蔗糖等一些小分子溶液，預先在分離超離心機的樣品地內製備出密度梯度，在其上面再加上一層少量的大分子溶液後，離心，大分子就形成層狀而沉降。若含有沉降係數不同的許多成分，就會出現許多層。這種情況採用適當的編排號碼，取出樣品池內的溶液，然後進行研究。這是與〔1〕不同的一種沉降速度法，除了以相同的目的被用於通常的沉降速度法外，在能取出分離物這點上是有優越性的。因多採用蔗糖密度梯度，所以亦稱為蔗糖密度梯度離心法。按同樣原理，也可使用分析超離心機進行測定。
摺疊編輯本段工作原理 又稱速率-區帶離心,沉降係數較接近的物質分離的方法;
原理:不同顆粒之間存在沉降係數差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區域上形成區帶的方法。
介質梯度應預先形成，介質的最大密度要小於所有樣品顆粒的密度。常用的有蔗糖、甘油;
密度梯度液的製備用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。
主要應用
可用來分離核酸、蛋白質、核糖體亞基及其它成分。
操作
純化病毒常用的方法是蔗糖密度梯度離心法，能得到比較純的病毒。其過程如下:
1、將收集的組織或臟器或其他,用玻璃勻漿器充分研磨後製成懸液,經反覆凍融3 次後,置- 20 ℃冰箱中,備用。
2、先以5000g離心15分鐘後，獲取上清夜，然後再20000g高速離心30分鐘後取上清夜。
3、接着10萬g超速離心2h，將沉澱用少量STE溶解。
4、先在超速離心管中加入5-8mL的第3步所獲取的含病毒樣品的溶解液，然後在離心管中依次加入30 % , 45 % , 60 %的蔗糖,加的時候是用長針頭從底部往上加的。11萬g離心2.5h,發現在30 %與45 % 以及45 % 與60 %之間都有一條明亮的帶，用長針頭將兩條不同部位的帶都吸取出來，分別收集到不同的瓶內。
5、去蔗糖;用STE緩衝液適量稀釋純化的病毒，然後11萬g離心3h,用少量STE(根據沉澱的量決定加入多少)緩衝液把沉澱懸起，即最後獲得了純化的病毒。-20度凍純備用，用時可用分光光度計測定其病毒含量。
注意事項
離心前將樣品小心鋪放在密度梯度溶液表面，離心形成區帶。離心後不同大小、不同形狀、有一定沉降係數差異的顆粒在密度梯度液中形成若干條界面清楚的不連續區帶。再通過虹吸、穿刺或切割離心管的方法將不同區帶中的顆粒分開收集，得到所需的物質。
1、梯度介質應具備足夠大的溶解度，以形成所需的密度梯度範圍。
2、梯度介質不會與樣品中的組分發生反應。
3、梯度介質也不會引起樣品中組分的凝集、變性或失活。
4、若離心時間過長由於顆粒的擴散作用，會使區帶越來越寬。為此，應適當增大離心力、縮短離心時間，可以減少由於擴散而導致的區帶擴寬現象。[1]