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| 角膜干细胞 | |
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角膜干细胞，角膜缘干细胞是指角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界部分，与角膜鉴别的标志是Bowman氏膜的终止处;与结膜的鉴别标志是不含杯状细胞。
概述发现
1 、角膜缘干细胞概述：角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界部分，与角膜鉴别的标志是Bowman氏膜的终止处；与结膜的鉴别标志是不含杯状细胞[5] 。角膜缘宽约1mm ，此处仅有上皮层和基质层, 其上皮细胞层超过10层，排列不规则，细胞呈小的圆柱状;深部基底细胞为一层小圆柱状或立方形细胞，细胞核为卵圆形，与表面平行，在基底部乳头形成特殊的“栅栏”（Vogt）样上皮结构，其中含有色素和丰富的血管网，并与基底膜联系紧密。[1] 2、角膜缘干细胞的发现：早在1940 年Hughes提出角膜缘局部缺血和角膜上皮缺损可提示角膜破损的范围，并作为烧伤眼的两个主要的预后因素，同时首次提出用角膜和角膜缘上皮移植的方法再造眼表面来改变患眼的预后，1960年Strampeli和1964年Burraquer等也提出了自体角膜缘移植术。后来Devanger和Everse等观察到角膜缘上皮是角膜上皮细胞的生长来源；1986年，Schermer 等[6] 首次通过实验证明角膜上皮干细胞位于角膜缘基底层，尤其是Vogt 栅栏区乳头状结构中的角膜缘基底细胞层。Vogt栅栏区乳头状结构中的某些基底细胞就是角膜缘干细胞，其依据为：①角膜缘基底部上皮含有角膜上皮中分化程度最低的细胞；角膜上皮表达K3是角膜上皮分化成熟的标志，角质蛋白K3和K12存在于角膜缘上皮基底层以上及整个角膜上皮，但不表达于基底层上皮及结膜上皮，表明基底层细胞包含分化最低的上皮细胞干细胞。②角膜缘基底层上皮含有具有干细胞增殖特性的细胞。③角膜缘上皮部分或全部缺损后角膜上皮的愈合反应支持干细胞位于角膜缘。④Pellegrini等发现P63 转录因子可以把人类角化细胞的干细胞和它们的短暂扩充细胞(TACS) 区别开来，它表达于角膜缘基底细胞核，但不表达于TACS。⑤正常角膜缘严重破坏时，移植自体或异体角膜缘上皮，可恢复正常角膜表面结构。
历史回顾
角膜缘干细胞治疗后第35天兔角膜缘可见多层上皮细胞，羊膜下可见炎性细胞浸润 HE染色 ×100当严重化学烧伤, 热烧伤眼后， 眼的角膜通常被广泛破坏，角膜上皮的修复出现困难，致使结膜上皮向角膜内生长，表现为角膜上皮结膜化，上皮附着松弛，容易脱落, 结果导致角膜上皮因长期慢性炎症刺激，发生愈合延迟，新生血管侵入、角膜结膜化和基质瘢痕化。通常情况下角膜上皮的细胞丢失可通过来源于角膜缘干细胞的上皮细胞替代。然而，一些病理性改变和损伤导致部分或全部角膜缘干细胞的缺乏，从而使正常的角膜更新机制失去功能。但角膜缘移植术可以通过修补角膜缘组织缺损，恢复干细胞数量，达到重建眼表面正常组织结构，从而保证高危角膜移植的成功。
角膜移植技术的理论自提出之后，相继有4种较成熟的方法可以运用于临床。
1、自体角膜缘干细胞移植自：1977 年Thoft成功应用自体结膜移植治疗化学烧伤角膜开始, 1989年Kenyon和Tseng开始了自体角膜缘移植术研究, 并应用于治疗各种原因导致角膜缘干细胞缺损为特征的角膜疾病中， 该手术将自体健眼包括角膜缘干细胞在内的球结膜组织片移植到患者的角膜缘部，其结果发现，比结膜移植有明显疗效， 移植后的角膜表面光滑，角膜新生血管消退，角膜上皮覆盖 ，这一事实进一步支持了角膜缘干细胞的功能与临床应用价值。但发现在自体供眼移植术中，如切取植片范围大于2 /3周，供体眼则产生不可逆的异常变化 ，而且在切取供体移植片时存在着一定的手术技术困难，对于双眼患者来说这种方式并不能完美的解决问题。因此有些学者提出了异体角膜缘干细胞移植的手术方式。
2、异体角膜缘干细胞移植：Tan等[和Coster等先后报道了采用同种异体角膜缘移植术重建眼表的病例，术后随访发现效果良好，重建的眼表稳定，角膜上皮完整，新生血管消退，部分视功能恢复。虽然为降低排斥反应，有人采用亲属间HLA-DR抗原相同或相近的角膜缘干细胞移植，并且在术后加用免疫抑制剂，但是毕竟是同种异体间的细胞移植，排斥反应仍旧很明显。于是在此基础上自体干细胞的培养和移植的手术方式也就被提出来了。
3、自体角膜缘干细胞体外培养移植：1997年Rellagrim等首次将体外培养的自体角膜缘干细胞移植到患眼上，并随访两年保持上皮的正常和完整性，成功地实现了眼表重建。后来的学者也以羊膜为载体进行同样的移植手术，实验证明角膜上皮形成。这种技术能够克服角膜缘干细胞匮乏的特点，成功率高，同时还避免了异体间的排斥反映，是一种理想的移植术。
4、异体角膜缘干细胞体外培养移植：对一些重症病人来说，自身角膜缘干细胞贫乏，采用异体角膜缘干细胞体外培养是一种可行的方法。1994年Tsai和Tseng实施了来源于尸眼上的遗体角膜缘移植，另外还有多位学者都进行异体角膜缘移植，术后疗效得到了提高，因体外培养同种异基因的角膜缘细胞植入异基因受体后，免疫原型随培养而降低。这样能从一定程度上减小排斥反映，但不能从根本上避免免疫排斥反映的发生，这仍然是该方面的一大障碍。
另外，有人提出可以将胚胎干细胞诱导形成角膜缘干细胞，为角膜缘干细胞移植和眼表重建提供了充足的细胞来源，而且该细胞个体间差异小，几乎无表面抗原表达，为治疗此类疾病提供了新的思路。
临床应用
角膜缘干细胞的移植要通过手术，这就涉及了适应症、供体选择、手术的技巧以及术后的康复等问题。
1、适应征[3、19、21]：一般适应于广泛角膜缘纤维性血管向内生长者, 且已持久或复发达7个月～20年不等的角膜上皮疾病。 中、重度化学烧伤或热烧伤; 慢性接触性相关角膜上皮病; 假性胬肉、翼状胬肉和复发性胬肉; (4)Terrien‘s边缘角膜变性; 慢性复发性角结膜炎; 角膜上皮瘤; Steve - jonnson综合征的表层; 多次角膜缘术后角膜表层瘢痕; (9) 持久性角膜上皮缺损。
2、供体的选择[3、22]：(1)自体角膜缘干细胞移植: 适应单眼发病的患者，取另一眼上方或下方角膜缘组织。(2)同种异体角膜缘干细胞移植: 活体- - 患者健康亲属, 如父母、兄弟等； 尸体- - 健康尸体眼球。[2] 3、植床准备：根据病灶大小，清除缺血的角膜缘结膜及结膜下瘢痕组织, 暴露2mm宽的巩膜及角膜缘组织片, 板层切除角膜表面不正常上皮、纤维血管翳、角膜表面瘢痕、使角膜创伤面平滑，避免角膜实质层切除。
4、植片大小[2、18、19]：根据病灶范围采取植片，取角膜缘015～1mm宽的表层透明角膜上皮并带有宽的2mm结膜, 避免取筋膜， 先切透明角膜边缘侧，再切结膜侧，活体供眼在表面麻醉取下， 创口可保留开放或用8～0号可吸收的缝线缝合伤口，所有活体供眼伤口快速愈合，无异常变化。植片大小从5mm～10mm不等，宽度2～3mm角膜缘组织，用10～0尼龙线在角膜缘侧间断缝合， 8～0可吸收缝线在巩膜侧间断缝合。
5、术后处理[18、19、20]：术毕结膜下注射抗生素、激素，单眼加压包扎，佩戴治疗性眼接触镜或睑缘缝合保护植片，术后3周拆除缝线，常规用抗生素和激素滴眼， 如为同种异体移植；术后可口服环胞霉素8～12 mg/kg，为期1周随后减为4～5mg/kg，持续2～6周, 全身应用环胞霉素时应注意肾功能和血压变化，可用1%环胞霉素A滴眼液滴眼，自体移植的角膜缘上皮在3天内可完全覆盖角膜， 同种异体移植在术后7天内, 术后2～9天移植的上皮已完全覆盖角膜。
6、术后并发症[18、20]：术后未遇到任何感染和植片移植急性失败, 术后并发症归纳如下：
（1）上皮生长迟缓： 常见的原因可有供体不理想, 植片覆盖不均匀，缝合技术失败及泪液分泌功能障碍等。
（2）植片裂开：常由于缝合不牢或过早拆线后未采取有效保护措施等原因造成。
（3）植片排斥反应： 同种异体移植后有些患者出现角膜缘血管充血, 继而诱发角膜上皮排斥， 通过局部应用糖皮质激素及环胞霉素A即可防治这种现象的发生。HLA基因配型从根本上防治异体移植排斥反应的发生。
（4）旧病复发： 因移植失败或移植的干细胞存活量太少，导致上皮再生不足等。
展望和问题
综上所述，角膜缘干细胞移植术是治疗眼表疾病、重建角膜结构的有效手段。
其中自体移植虽然有诸多优点，如移植成功率是最高的，没有排斥反应，组织来源方便等， 但仅能供单眼发病的病例, 手术取植片范围常常受限。目前我国每年所实施的角膜移植例数远不及每年递增的角膜病患者。
培养角膜缘干细胞是基于对角膜缘干细胞的深入认识和对传统方法的重大革新,具有良好的发展前景。
它的优点是：1、所需角膜缘组织极少，对供眼无潜在威胁；2、培养的细胞可冰存用于二次手术；3、能抑制眼表急性病变的发展,迅速恢复术眼正常的眼表结构；4、可避免使用异体移植而导致的免疫排斥反应；5、解决了供体来源不足的难题。这一方法是最有前途的研究方向, 一旦该方法研究成熟, 可解决角膜缘干细胞的来源。
虽然如此，但还有很多工作需要做，如培养后的角膜干细胞分化及生理生化的变化、如何选择安全可靠的载体、培养的肝细胞如何保存效果会更好、异体移植后如何降低排斥反映的发生等一系列问题都亟待解决。