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PCR技術

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PCR技術是模擬體內DNA的天然複製過程，在體外擴增DNA分子的一種分子生物學技術，主要用於擴增位於兩段已知序列之間的DNA區段。在待擴增的DNA片段兩側和與其兩側互補的兩個寡核苷酸引物，經變性、退火和延伸若干個循環後，DNA擴增2ⁿ倍。

PCR的每個循環過程包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個不同的事件:(①變性:加熱使模板DNA在高溫下(94℃左右)雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈;②退火;使溶液溫度降至50~60℃，模板DNA與引物按鹼基配對原則互補結合，③延伸:溶液反應溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)，按5'一3'方向複製出互補DNA。 PCR技術的基本原理

⑴PCR技術的基本原理：該技術是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴於DNA聚合酶的酶促合成反應。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，藉助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3´-OH末端，並以此為起始點，沿模板5´→3´方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。

PCR反應的基本成分包括：模板DNA(待擴增DNA)、引物、4種脫氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和適宜的緩衝液。類似於DNA的天然複製過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的高溫變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的低溫退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的適溫延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留複製鏈重複循環變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的「半保留複製鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

⑵PCR的反應動力學： PCR的三個反應步驟反覆進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴增後的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。 反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨着PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA 片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期， 即出現「停滯效應」 ，這種效應稱平台期數、PCR 擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素。大多數情況下，平台期的到來是不可避免的。

⑶PCR擴增產物 ：可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5'端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由於引物所結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中， 以兩條互補的DNA為模板，引物是從3'端開始延伸， 其5'端是固定的，3' 端則沒有固定的止點，長短不一，這就是「長產物片段」。進入第二周期後，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即「長產物片段」)結合。引物在與新鏈結合時， 由於新鏈模板的5'端序列是固定的， 這就等於這次延伸的片段3'端被固定了止點， 保證了新片段的起點和止點都限定於引物擴增序列以內、形成長短一致的「短產物片段」。不難看出「短產物片段」是按指數倍數增加， 而「長產物片段」則以算術倍數增加， 幾乎可以忽略不計， 這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。