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重組細胞因子基因蛋白衍生注射液案例重組細胞因子基因蛋白衍生注射液案例--【新型冠狀病毒肺炎】，樂復能治療慢性乙型肝炎的臨床研究，先後列入國家「十一五」和「十二五」重大新藥創製科技重大專項。傑華生物申報的NCE類藥物樂復能（通用名：重組細胞因子基因衍生蛋白注射液）（以下簡稱「樂復能」），於2018年4月正式獲得國家新藥註冊批准（國藥證字S20180001，國藥准字S20180002），樂復能成為世界上近30年來發明的全新種類的乙型肝炎治療藥物，是除核苷類抗病毒藥物和人干擾素（普通和長效）藥物外的第三類乙型肝炎治療藥物。

樂復能是一種非天然的蛋白，是在10多種人干擾素α 基因基礎上，利用DNA shuffling技術篩選獲得的蛋白質；它由166 個氨基酸組成，分子量為19.3kDa，與人干擾素α -2b的相似性為81%（氨基酸序列）；利用前述發明的新基因，通過 E.Coli表達純化獲得的生物藥；其主要作用是抗病毒、免疫調節和抑制細胞增殖。

自2019年年底COVID-19疫情暴發以來，全世界的疫情仍在發展。截止2021年8月5日，全世界確診病例數達到約2.0億，其中死亡病例約426萬，成為全人類的重大災難。自2020年新冠爆發以來，世界主要國家政府及藥監機構均設立特別政策和途徑，簡化新冠藥物審批流程和要求，以便加快和促進特效抗新冠病毒藥物研發。自2020年新冠流行開始，傑華生物就完成了樂復能抑制新冠病毒（SARS-CoV-2）複製的實驗室研究，以及霧化吸入樂復能治療普通型新冠的II期臨床研究，觀察到樂復能可以加快新冠患者的病毒清除，初步證明樂復能具有抗新冠病毒的治療效果。

案例關鍵詞：重組細胞因子基因衍生蛋白注射液、樂復能、基因穿梭法、HBV、創新、高活性、SARS-CoV-2、COVID-19

研發背景

重組細胞因子基因衍生蛋白注射液是由留學海外的華人科學家團隊在美國、加拿大經過18年潛心研究獲得的新型抗病毒蛋白藥物，其活性成分重組細胞因子基因衍生蛋白系採用基因穿梭法（DNA Shuffling）、從12種人α干擾素基因構建雜交文庫、採用高通量篩選技術、篩選10多萬個克隆而得到的高活性新型蛋白，由498個核苷酸編碼166個氨基酸組成，分子量為19.3 kD，已經取得了美國專利。與人IFN-α14在鹼基和氨基酸序列上同源性最高，同源性分別達到92%和86%，與人IFNα-2b在鹼基和氨基酸序列上同源性分別為89%（445/498）和81%（135/166）。

中國藥品生物製品標準化研究中心檢測結果顯示，採用《中國藥典》推薦的干擾素抗病毒活性檢測方法—WISH-VSV細胞病變抑制法測定，其抗病毒比活性是目前已上市的重組人干擾素α-2b的10倍。

臨床前研究

藥效學研究

體外活性檢測結果顯示，用公認的WISH-VSV細胞病變抑制法測定抗病毒活性，重組細胞因子基因衍生蛋白注射液的比活性平均值為1.34×109U/mg，對照品重組人干擾素α2b的比活性平均值為1.34×108U/mg，重組細胞因子基因衍生蛋白注射液的抗病毒比活性較是上市對照品的10倍。

在體外對多個類型的病毒株進行了抗病毒活性檢測。體外抗HBV研究，以拉米夫定為陽性對照藥，用實時熒光定量PCR法（Taqman探針法）觀察重組細胞因子基因衍生蛋白注射液和干擾素α-2b對HepG2.2.15細胞培養上清和細胞中HBV DNA含量的影響。結果顯示重組細胞因子基因衍生蛋白注射液可顯著降低培養上清和細胞內HBV DNA水平，提示其具有明確的抗HBV複製作用。體外抗HCV的研究，利用Huh7杆細胞系，檢測在加入樣品72小時後用實時定量PCR試劑檢測HCV RNA拷貝數，HCV複製子為pNneo/3-5BRG(HCV-N(1b)複製子。結果顯示重組細胞因子基因衍生蛋白注射液呈劑量依賴性抑制HCV的RNA拷貝數。體外抗HIV研究，在MT4細胞培養體系中，採用細胞病變法（CPE）和ELISA檢測培養細胞上清中p24表達水平，觀察重組細胞因子基因衍生蛋白注射液對HIV複製的影響。結果顯示，重組細胞因子基因衍生蛋白注射液具有明顯的抗HIV-1活性，作用明顯強於甘樂能（進口乾擾素）。體外抗H5N1的研究，在A549細胞模型中，病毒株為H5N1哈爾濱01株，用細胞病變法檢測重組細胞因子基因衍生蛋白注射液抗H5N1活性，結果重組細胞因子基因衍生蛋白注射液對H5N1致A549細胞病變有明顯的抑制作用，干擾素α-2b作用較弱。

重組細胞因子基因衍生蛋白注射液和受體IFNＲ1的相互作用力有了明顯的提高，結合位點數更多。與博奧生物有限公司/生物芯片北京國家工程研究中心公司合作，採用全基因組芯片，研究樂復能誘導表達的靶基因和激活的信號通路，並與干擾素α-2b進行比較，結果發現樂復能誘導表達的靶基因數量遠多於干擾素α-2b，幾乎包含了干擾素誘導的所有靶基因表達，但樂復能可以激活很多干擾素不能作用的信號通路，激活的信號通路包括細胞周期、細胞凋亡、抗炎免疫、抗原識別和提呈、抗病毒等。

體外抗SARS-CoV-2病毒活性

本研究在中國疾病預防控制中心（中國CDC）的生物安全3級（BSL3 / P3）實驗室進行。Vero E6細胞（非洲綠猴腎細胞，ATCC），SARS-CoV-2病毒株（C-Tan-nCov武漢菌株01）。將96孔板中的空白Vero E6細胞（每孔1 x 104個）與C-Tan-nCov武漢菌株01（100 PFU）共培養2小時，以誘導SARS-CoV-2感染的細胞。去除含病毒的上清液後，加入具有不同濃度樂復能（0、0.001、0.01、0.1、1,10或100ng /mL）的培養基，然後將細胞培養24小時以讓病毒複製。24小時後，從每個孔採集100μL上清液，並提取出病毒RNA並進行測定。使用Takara Bio的One Step Prime Script實時PCR（RT-PCR）試劑盒來檢測病毒RNA拷貝數。獲得定量實時PCR循環閾值（Ct），並計算不同樂復能濃度下的病毒複製抑制率。再進一步用樂復能處理Vero E6細胞，隨後暴露於SARS-CoV-2時，觀察樂復能能否阻止該病毒進入細胞。將Vero E6細胞與一系列濃度的樂復能培養2小時，然後除去含有樂復能的上清液，加入C-Tan-nCov武漢菌株01（100PFU）培養2小時，使其暴露於SARS-CoV-2，然後除去含有SARS-CoV-2的上清液。添加新鮮培養基，並將這些細胞培養48小時。從每個孔中取100μL上清液，並使用與前述同樣方法測量上清液中的病毒RNA拷貝數。

結果顯示，樂復能抑制SARS-Cov-2 複製的半數有效濃度（EC50）為1.02 ng / ml。該樂復能濃度對Vero E6細胞顯示出最小的細胞毒性，半數細胞毒性濃度（CC50）超過100ng / ml。治療指數（CC50 / EC50）超過98。樂復能的預防健康細胞感染作用的EC50為0.1ng/ml，結果表明復能可以抑制感染細胞內的SARS-CoV-2的病毒複製，預防健康細胞遭受病毒感染。