RNA聚合酶檢視原始碼討論檢視歷史

原圖鏈接免費文檔

RNA聚合酶（RNA polymerase），或稱核糖核酸聚合酶，是以一條DNA鏈或RNA為模板，三磷酸核糖核苷為底物、通過磷酸二酯鍵而聚合的合成RNA的酶。因為在細胞內與基因DNA的遺傳信息轉錄為RNA有關，所以也稱轉錄酶。它是一種非常重要的酶，且可在所有生物、細胞及多種病毒中可見。

基本介紹

RNA聚合酶（RNA polymerase）：以一條DNA鏈或RNA為模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。

催化轉錄的RNA聚合酶是一種由多個蛋白亞基組成的複合酶。如大腸桿菌的 RNA聚合酶有五個亞基組成，其分子量為480000，含有α，β，β』，σ，ω等5種不同的多肽，其中α為兩個分子，所以全酶（holoenzyme）的組成是α2ββ』σω。σ亞基與RNA聚合酶的四聚體核心（α2ββ』）的形成有關；β亞基與起始和催化聚合反應有關；β』亞基含有與DNA模板的結合位點；而σ因子只與RNA轉錄的起始有關，與鏈的延伸沒有關係，一旦轉錄開始，σ因子就被釋放，而鏈的延伸則由四聚體核心酶（core enzyme）催化。所以，σ因子的作用就是識別轉錄的起始位置，並使RNA聚合酶結合在啟動子部位；ω亞基作用暫不明確。

細菌的RNA聚合酶，像DNA聚合酶一樣，具有很複雜的結構。其活性形式（全酶）為15S，由5種不同的多肽鏈構成，按分子量大小排列分別為β'(155000），β（151000），σ(70000），α（36500）和ω（11000）。每分子RNA聚合酶除有兩個α亞基外，其餘亞基均只有一個，故全酶為β'βα2σω（450000）

如果全酶為球狀，則可計算其直徑約為100A，即約為雙鏈DNA的30bp節段的長度。然而全酶可結合約60個核苷酸，提示其形狀應為橢圓球形。

σ亞基和其他肽鏈的結合不很牢固。當σ亞基脫離全酶後，剩下的β'βα2ω稱為核心酶。核心酶本身就能催化核苷酸間磷酸二酯鍵的形成，不論有無σ存在的利福平（rifampicin）和利福黴素（rifamycin）能結合在β亞基上而對此酶發生強烈的抑制作用。它抑制RNA合成的起始而不抑制其延長。β亞基的基因rpoB的突變可使細菌對利福平有抗性。而另一種抗生素鏈霉溶菌素（streptolydigin）能抑制RNA鏈的延長，rpoB的突變卻可使細胞對鏈霉溶菌素亦發生抗性。總的看來β亞基似乎是酶和核苷酸底物結合的部位。肝素能與DNA競爭與RNA聚合酶相結合。肝素是一種多價陰子，能和β'亞基結合，從而在體外抑制轉錄作用。可見β'亞基的鹼性較強，適於與模板DNA相結合。α亞基的功能現尚未知。然而，當噬菌體T4感染E.coli時，其α亞基即在精氨酸上被ADP-核糖化。這種修飾作用使該RNA聚合酶全酶對其原先識別的啟動子的親和力減弱。所以有人認為，α亞基的功能可能是識別其相應的啟動子

啟動環

啟動環（triggerloop，TL）結構是真核生物和原核生物RNA聚合酶中的一個高度保守區域，但它在轉錄過程的確切功能還不甚了解。美國斯坦福大學的Kaplan等人的最新研究發現，TL在底物選擇過程中發揮重要功能，是真菌毒素α鵝膏覃鹼（α-amanitin）的直接作用位點。該研究結果發表的《分子細胞》（MolecularCell）上。以往研究表明，TL結構直接與新合成RNA的3'端和NTP相互作用，其中一個保守的組氨酸殘基直接與NTP底物相結合。Kaplan等人用其他氨基酸替代釀酒酵母RNA聚合酶Ⅱ中TL結構中的His1085殘基，結果導致釀酒酵母表現出嚴重的生長缺陷，甚至無法存活。離體實驗表明，His1085能夠選擇正確的NTP底物，該位點變異後，聚合酶Ⅱ摻入錯誤的NTP底物和2'dNTP底物的可能性大大增加。

α鵝膏覃鹼能夠抑制RNA聚合酶Ⅱ的延伸速率，降低其底物選擇性，但His1085被替代後的RNA聚合酶Ⅱ對α鵝膏覃鹼則具有較高的抗性。研究人員進一步研究了純化的RNA聚合酶－α鵝膏覃鹼複合體的晶體結構，發現α鵝膏覃鹼和TL結構間存在直接的相互作用。因此，研究人員認為，α鵝膏覃鹼通過直接作用於TL結構而降低RNA聚合酶Ⅱ的速率和保真度。

結構

為什麼細菌的RNA聚合酶需要這麼大和複雜的分子結構呢?而某些噬菌體特有的RNA聚合酶則要小得多，僅由一條多肽鏈組成。這證明RNA合成所需的機構可以遠比宿主的酶小。這種情況說明，噬菌體內的轉錄僅需一條"最小"的機構。然而這種酶只能識別噬菌體本身所有的少數幾個啟動子；它們不能識別其他啟動子。例如噬菌體T3和T7的RNA聚合酶分子很相似，二者都不過是一條多肽鏈，分子量約11000。它們能很快合成RNA。其速率在37℃時可達約200核苷酸/秒。

相比之下，宿主細胞的RNA聚合酶卻能轉錄細胞內的許多轉錄單位(>1000個）中的任意一個。這些轉錄單位中有一些可由RNA聚合酶直接轉錄，不需要其他因子的幫助。但大多數這些轉錄單位僅在更多的蛋白質因子存在下才能被該RNA聚合酶所轉錄。所以，可以想像宿主細胞所以要求這樣大和複雜，至少部分反映了它需要和許多其他因子相互作用，而不是其催化活性的固有的要求。

E．coli的RNA聚合酶各亞基的基因（除ω亞基的基因尚不詳外）均存在於三個操縱子中，這些操縱子還含有蛋白質合成和DNA合成所需的基因。P71主要啟動子（P）均在操縱子的左側，RNA則向右方合成。次要啟動子（p）包括σ操縱子中的一個啟動子（PHS，是在熱休克條件下才有活性的啟動子），均位於操縱子之內。這些次要啟動子僅啟動在其右側的基因。β操縱子的前面兩個基因L11和L1，有時被認為組成另一個獨立的操縱子，因為在L10基因之前另有一啟動子。這些基因編碼50個左右核糖體蛋白質中的某些蛋白質。σ操縱子中還含有複製所需的蛋白質，即DNA引物酶的基因。還不清楚這些操縱子是如何進行調節的。

σ操縱子有兩個連續的啟動子，就像rRNA的操縱子一樣。受到ppGpp分子的調控，故與生長速度有關。這些操縱子中的基因並不是相等地被轉錄的：在σ和β操縱子開始中的核糖體蛋白質基因的後面有衰減子（attenuators），可使其後的RNA聚合酶基因的轉錄大為降低。因此，在每個細胞中RNA聚合酶亞基的數目（約3000個）要大大少於核糖體蛋白質的分子數（約20000個），這是符合細菌的需要的。然而令人不解的是DNA引物酶基因位於σ基因之前，然而在細胞內σ亞基的數目反而要比引物酶分子數多60倍（3000比50）。這可能是因為編碼引物酶的mRNA節段要比其餘mRNA部分不穩定得多。這些操縱子內都有幾個次要的啟動子，包括σ操縱子內的一個可被熱休克所激活，說明實際的調控作用還要更為複雜得多。

代換

T7噬菌體在轉錄的時序調控中不是採用σ因子的級聯取代，也不是像T4噬菌體那樣對核心酶進行修飾，而是根據自動的感染特點採用了RNA聚合酶的代換來進行時序轉錄的調控。T7是E.coli的烈性噬菌體，基因組長為39,936nt，順序已知。整個基因組可能具有55個基因，其中44個基因的產物已鑑別出了，已知30種是有功能的轉錄可分為3組，30°C整個生活周期約為25¢；分鐘，但其DNA的注入很慢，整個的過程約10分鐘，而其它的噬菌體僅1分鐘即可完成。這也是一種調控的手段，因未注入宿主細胞中的DNA是不能轉錄的。在感染6分鐘後，E.coli的RNA合成體系全部被T4的合成體系所取代。

在感染後的前6分鐘，T7噬菌體的RNAPol尚未表達，因此仍使用了宿主E.coli的RNA聚合酶，轉錄的基因主要有10個（0.3,0.4,0.5,0.6,0.65,0.7,1,1.1,1.2,1.3），其0.3基因編碼宿主限制酶的抑制蛋白，使T7進入宿主免遭降解；0.7基因編碼一種蛋白激酶，能將E.coli的RNA聚合酶磷酸化，為抑制宿主RNAPol作準備；基因1編碼T7RNAPol聚合酶，分子量為98KDa，是一條單鏈肽，它所識別的啟動子是由23bp組成的保守順序（-17～16）。

晚期轉錄分為二組（Ⅱ和Ⅲ）。感染後6～12分鐘後T7就利用自己的RNA聚合酶轉錄第Ⅱ組轉錄物。這一組約含（1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,2,2.5,2.8,3,3.5,3.8,4,5,5.7,6），其中對轉錄調控有關係的是基因2，其產物是E.coli聚合酶抑制劑。宿主的RNA聚合酶先受到基因0.7產物的磷酸化，再經抑制完全失去了作用，此時T7已不再需要I組的轉錄物了，因此廢除了宿主RNA聚合酶的功能，而將自己編碼的RNA聚合酶取而代之。第Ⅱ組的基因多與T7的複製酶系的合成及幾種結構蛋白有關，但第Ⅱ組的啟動子和複製的φL啟動子因其保守順序中分別有2～7個鹼基發生了改變，所以是較弱的啟動子，但由於其位置排在Ⅲ組啟動子的前面，所以先進入宿主得以轉錄，而不與第Ⅲ組啟動子的競爭。

晚期轉錄的另一組基因就是第Ⅲ組轉錄物，它排在最後，故在感染12分鐘後才得以表達。此轉錄物約含15個基因，它們主要編碼頭部蛋白，尾部蛋白以及負責裝配，這樣使得T7噬菌體不至於過早地裝配成粒子。這一組雖排在最後，但啟動子的結構和保守順序完全一致所以是極強的啟動子，從而保證最後階段結構蛋白的合成。第Ⅰ組轉錄的終止位置在鄰近1.4基因的上游區（1.3和1.4之間），此是E.coliRNA聚合酶的終止子）它解離後T7RNA聚合酶則重新從第Ⅱ組起始轉錄。第Ⅱ組和第Ⅲ組都使用終止子Tj，由於自注入宿主緩慢，在第Ⅱ組轉錄時第Ⅲ組基因尚未注入，仍得不到表達。

Tj的終止效率是90%，尚有10%可以延長轉錄T7的末端，Tj位於基因10和11之間。基因10是主要的頭部蛋白，需要量大，它排在第Ⅱ組末是合理的，即有強啟動子的啟動，又在轉錄後被終止，這樣不僅滿足了裝配顆粒的需要，又不至造成浪費。而排在基因10後面的基因都是編碼少量頭部蛋白和尾部蛋白的，無需大量的轉錄，後面越過Tj延長轉錄的強度就可滿足需要了，這本身也是一種終止子對轉錄的調控。

作用

RNA聚合酶（RNA polymerase）的作用是轉錄RNA。有的RNA聚合酶有比較複雜的亞基結構。如大腸桿菌RNA聚合酶有四條多肽鏈，另有一個促進新RNA分子合成的σ因子，因此它的組成的是α2ββσ。這種結構稱為全酶（holoenzyme），除去了σ因子的酶稱為核心酶。噬菌體RNA聚合酶則沒有亞基。

真核生物的RNA聚合酶分三類。RNA聚合酶Ⅰ存在於核仁中，轉錄除5S rRNA以外的rRNA序列。RNA聚合酶Ⅱ存在於核質中，轉錄大多數基因，需要「TATA」框。RNA聚合酶Ⅲ存在於核質中，轉錄很少幾種基因如tRNA基因，以及5S rRNA基因。有些重複順序如Alu順序可能也由這種酶轉錄。上面提到的「TATA」框又稱Goldberg –Hogness順序，是RNA聚合酶Ⅱ的接觸點，是這種酶的轉錄單位所特有的。它在真核生物的轉錄基因的5』端一側，在轉錄起點上游20至30個核苷酸之間有一段富含AT的順序。如以轉錄起始點為0，則在-33到27個核苷酸與-27至21核苷酸之間，有一個「TATA」框。一般是7個核苷酸。原核生物中也類似「TATA」框的結構。RNA聚合酶作用在「TATAAT」（Pribnow）盒和「TTGA－CA」框附近。

研究進展

在美國著名哲學家愛默生（RalphWaldoEmerson）說「大自然容不得任何錯誤」的時候，他一定沒有考慮過RNA聚酶（RNApolymerase，RNAP），這一能將遺傳物質DNA與生物功能表現者蛋白聯繫起來的不二功臣實際上在轉錄的時候會發生很多錯誤，但是它也有「自知之明」會及時將這些錯誤更正過來。這一由Stanford大學StevenBlock實驗室完成的研究發表在11月Nature上面。RNA聚合酶（RNAP），只要是稍微接觸過分子生物學的人就不會對這個名詞陌生，在DNA要將它的遺傳信息表達出去，成為真正具有功能效應的單位——蛋白的時候，需要中間體RNA的幫助，而要實現這個過程就不能缺少這個重要的酶。StevenBlock和他的同事利用一種比之前光阱（opticaltrap）更穩定的裝置發現在大腸桿菌轉錄的過程中，這個酶每隔大約1000個鹼基就會出現一個錯誤，但是RNAP也有良好的自我糾正機制，能及時發現和糾正這些錯誤。

在這一研究中，StevenBlock研究小組改進了光阱，使之放大了10倍，這樣研究人員就可以直接觀察到RNA聚合酶的每一步動作了，這幫助深入了解了之前並未完全研究清楚的基因轉錄和調節的過程。而且利用這種裝置，研究人員排除了RNAP偶然性的停頓和迴轉，可以分析一個完全單獨的延伸過程，結果他們發現由於RNAP在前進的過程中會結合一個新的NTP，因此導致RNAP一次滑過一個鹼基對來確保轉錄過程的準確性，這被稱為布朗荊輪（brownianratchet）。這一研究獲得了許多科學家的認可，德克薩斯大學健康中心的RuiSousa認為這是一項迄今為止最好的布朗荊輪的證明，但是也有科學家對此表示懷疑態度。

比較

概述 DNA連接酶：主要是連接DNA片段之間的磷酸二酯鍵，起連接作用，在基因工程中起作用。

DNA聚合酶：催化脫氧核苷酸之間的聚合反應。主要是脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵，在DNA複製中起做用。

DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。

DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。

RNA聚合酶（又稱RNA複製酶、RNA合成酶）的催化活性：RNA聚合酶以完整的雙鏈DNA為模板，轉錄時DNA的雙鏈結構部分解開，轉錄後DNA仍然保持雙鏈的結構。真核生物RNA聚合酶：真核生物的轉錄機制要複雜得多，有三種細胞核內的RNA聚合酶：RNA聚合酶I轉錄rRNA，RNA聚合酶Ⅱ轉錄mRNA，RNA聚合酶Ⅲ轉錄tRNA和其它小分子RNA。在RNA複製和轉錄中起作用。

模板和酶 1．模板RNA的轉錄合成需要DNA做模板，DNA雙鏈中只有一股鏈起模板作用，指導RNA合成的一股DNA鏈稱為模板鏈（template strand）或稱反義鏈（antisense strand），與之相對的另一股鏈為編碼鏈（coding strand）或稱有意義鏈（sense strand），不對稱轉錄有兩方面含義：一是DNA鏈上只有部分的區段作為轉錄模板（反義鏈或模板鏈），二是模板鏈並非自始至終位於同一股DNA單鏈上。

2．RNA聚合酶轉錄需要RNA聚合酶。原核生物的RNA聚合酶由多個亞基組成：α2ββ'稱為核心酶，轉錄延長只需核心酶即可。α2ββ'σ稱為全酶，轉錄起始前需要σ亞基辨認起始點，所以全酶是轉錄起始必需的。真核生物RNA聚合酶有RNA-polⅠ、Ⅱ、Ⅲ三種，分別轉錄45s-rRNA; mRNA（其前體是hnRNA）；以及5s-rRNA、snRNA和tRNA。

3．模板與酶的辨認結合

轉錄模板上有被RNA聚合酶辨認和結合的位點。在轉錄起始之前被RNA聚合酶結合的DNA部位稱為啟動子。典型的原核生物啟動子序列是-35區的TTGACA序列和-10區的Pribnow盒即TATAAT序列。真核生物的轉錄上游調控序列統稱為順式作用元件，主要有TATA盒、、CG盒、上游活化序列（酵母細胞）、增強子等等。和順式作用元件結合的蛋白質都有調控轉錄的作用，統稱為反式作用因子。反式作用因子已發現數百種，能夠歸類的稱為轉錄因子（TF），相應於RNA-polⅠ、Ⅱ、Ⅲ的是TFⅠ、TFⅡ、TFⅢ。TFⅡ又有A、B、C、D、E、F多種及其亞類。

基本概念：

1．不對稱轉錄：兩重含義，一是指雙鏈DNA只有一股單鏈用作轉錄模板（模板鏈）；二是對不同基因同一單鏈上某些區段作為模板鏈而另一些區段作為編碼鏈，即模板鏈並非永遠在同一單鏈上。

2． 編碼鏈：DNA雙鏈上不用作轉錄模板的那一段單鏈，因其鹼基序列除由T代替U而外，其他與轉錄產物mRNA序列相同而得名。

3．σ（sigma）因子：原核生物RNA聚合酶全酶的成份，功能是辨認轉錄起始區，這種σ因子稱σ70，此外還有分子量不同，功能不同的其他σ因子。

基本要求：掌握轉錄與複製的區別，轉錄的不對稱性，原核生物的RNA聚合酶的組成及各亞基的功能，真核生物RNA聚合酶的分類、性質及功能，原核生物啟動子的結構特點，了解真核生物RNA聚合酶的組成，研究轉錄起始區的方法。

轉錄過程 1．轉錄起始：轉錄的起始就是生成由RNA聚合酶，模板和轉錄5'端首位核苷酸組成的起始複合物。原核生物RNA5'端是嘌呤核苷酸（A、G），而且保留三磷酸核苷的結構，所以其起始複合物是：pppG-DNA-RNA聚合酶。

真核生物起始，生成起始前複合物（PIC）。例如RNA-pol-Ⅱ轉錄，是由各種TFⅡ相互辨認結合，再與RNA聚合酶結合，並通過TF結合到TATA盒上。

2． 轉錄延長：轉錄的延長是以首位核苷酸的3'-OH為基礎逐個加人NTP即形成磷酸二醋鍵，使RNA逐步從5'向3'端生長的過程。在原核生物，因為沒有細胞膜的分隔，轉錄未完成即已開始翻譯，而且在同一DNA模板上同時進行多個轉錄過程。電鏡下看到的羽毛狀圖形和羽毛上的小黑點（多聚核糖體），是轉錄和翻譯高效率的直觀表現。

3．轉錄終止：轉錄的終止在原核生物分為依賴Rho因子與非依賴Rho因子兩類。Rho因子有ATP酶和解螺旋酶兩種活性，因此能結合轉錄產物的3'末端區並使轉錄停頓及產物RNA脫離DNA模板。非依賴Rho因子的轉錄終止，其RNA產物3'-端往往形成莖環結構，其後又有一串寡聚U。莖環結構可使因子聚合酶變構而不再前移，寡聚U則有利於RNA不再依附DNA模板鏈而脫出。因此無論哪一種轉錄終止都有RNA聚合酶停頓和RNA產物脫出這兩個必要過程。真核生物轉錄終止是和加尾（mRNA的聚腺昔酸poly A）修飾同步進行的。RNA上的加尾修飾點結構特徵是有AAAUAA序列。

基本概念：

1．轉錄起始前複合物 (pre-initiation complex,PIC)：是真核生物轉錄因子與RNA聚合酶一同結合於轉錄起始前的DNA區域而成的複合物。

2．加尾修飾點：真核生物mRNA轉錄不是在mRNA的位置上終止，而是在數百個核苷酸之後，研究發現在編碼鏈讀碼框架的3'端之後，常有一組共同序列AATAAA，再下游還有相當多GC的序列，這些序列稱為加尾修飾點，轉錄越過修飾點後，mRNA在修飾點處被切斷，隨即加入polyA。

3．Rho因子：是原核生物轉錄終止因子，有ATP酶和解螺旋酶活性。轉錄終止也可不依賴Rho因子。

三．真核RNA的轉錄後加工

1．mRNA轉錄後加工

真核生物轉錄生成的RNA，多需經加工後才具備活性，這一過程稱為轉錄後修飾，mRNA轉錄後修飾包括首、尾修飾和剪接。加尾修飾是和轉錄終止同步的，5'端修飾主要是指生成帽子結構，即把5'-pppG轉變為5'-pmGpppG。其過程需磷酸解、磷酸化和鹼基的甲基化。mRNA由hRNA加工而成。真核生物基因由內含子隔斷編碼序列的外顯子，是斷裂基因。內含子一般也出現在轉錄初級產物hRNA。切除內含子，把外顯子連結在一起，就是剪接加工。在電鏡下看到加工過程，內含子往往被彎曲成套索狀，因此稱為套索RNA。知道剪接加工中，需要由多種Sn-RNA與蛋白質共同組成的並接體。並接體和hnRNA上的內含子邊界序列辨認結合。剪接過程先由含鳥苷酸的酶提供3'-OH對其中內含子5'-端的磷酸二酯鍵作親電子攻擊使其斷裂。斷裂的外顯子3'-OH對內含子3'-端的磷酸二酯鍵作親電子攻擊，使剛斷出的外顯子完全置換了內含子，兩個外顯子就相連起來，因此這個過程稱二次轉酯反應。

2．tRNA轉錄後加工

tRNA的轉錄後修飾，除了剪接加工外，還包括tRNA鏈上稀有鹼基的形成，以及加上3'端的CCA序列。

3．rRNA的轉錄後加工

rRNA加工多採用自我剪接的形式。自我剪接的RNA本身形成一種特別的二級結構，稱為錘頭結構。錘頭結構是指複合的莖環組成形態，但其中某些序列上必需是特定的鹼基所占據。這種RNA結構，不需要任何蛋白質，就可以水解RNA鏈上某一特定位點的磷酸二酯鍵。也就是說，這是一種起催化作用的RNA，現稱為核酶。核酶的發現，對酶學、分子生物學，進化生物學都是重要的理論更新，而且，醫學上已開始利用人工設計的核酶，去消滅一些作為病原體的RNA病毒或消除一些不利於生命活動的細胞內RNA。

基本概念：

1．剪接修飾：RNA轉錄初級產物含有非編碼組分，通過剪接除去非編碼組分，把編碼組份連接起來。剪接修飾最常見的是靠並接體協助的二次轉酯反應，此外還可有自我剪接及需酶的剪接等剪接方式。

2．外顯子：定義為斷裂基因上及其轉錄初級產物上可表達的序列。或轉錄初級產物上通過拼接作用而保留於成熟的RNA中的核苷酸序列或基因中與成熟RNA相對應的DNA序列．

3．內含子：早期定義為核酸上的非編碼序列。隨着內含子功能的被拓寬，建議用"轉錄初級產物上通過拼接作用而被去除的RNA序列或基因中與這種RNA序列相對應的DNA序列"較全面。

4．並接體：由snRNA和蛋白質組成的核糖核酸蛋白（核蛋白）複合物。其功能是結合內含子兩端的邊界序列，協助RNA的剪接加工。

5．核酶（ribozyme）：具有催化功能（酶的作用）的RNA分子。核酶能起作用的結構，至少含有3個莖（RNA分子內配對形成的局部雙鏈），1至3個環（RNA分子局部雙鏈鼓出的單鏈）和至少有13個一致性的鹼基位點。