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妈阁庙的建庙年份至今未有定论，在史学界中亦是具争论性的话题，现时大部分学者认定在葡萄牙人定居澳门前（即1553年至1557年前），在妈阁庙现址已有供奉妈祖的庙宇存在。其中澳门历史学家吴志良和金国平指出，早期的葡萄牙文文献、著作基于澳门葡萄牙人古老的传说，均称葡萄牙人在1553至1557年抵达澳门时已发现了妈祖庙，并将之定为妈阁庙建庙年份的下限于1582年8月抵达澳门的天主教耶稣会传教士利玛窦在他的著作《中国札记》中，提到该处有一座妈祖庙殿；从1751年完稿《澳门记略》的附图上可见，当时整座庙宇已有一定规模；1828年（清道光八年），妈阁庙重修，庙内建筑大为完善。于1874年（同治十三年）及1875年（光绪元年），妈阁庙两度遭受飓风破坏而受损，经两年重修扩建后，奠定今天的模样。