變更

多光子显微镜的操作类似于[[激光扫描共聚焦显微镜|共聚焦激光扫描显微镜]] <ref>[https://www.sohu.com/a/403805446_680608 【科研方法】激光扫描共聚焦显微镜技术使用指南]，搜狐，2020-06-24 </ref> 的操作。 然而，虽然共聚焦激光扫描显微具有50-80 μm的穿透深度，取决于制剂，可以与多光子显微镜一起使用更深的区域，例如，200 μm，在非常有利的情况下甚至可达到1000 μm（= 1 mm）。 活体组织的这一图像可能是用其它方法无法成像。

双光子显微镜由温弗里德·登克(Winfried Denk)和James Strickler于1990年在[[康奈尔大学]]的瓦·韦伯(Watt W. Webb)实验室开创并获得[[专利]] <ref>[https://www.sohu.com/a/239429211_650136 程和平院士专访 | 自主研发微型化双光子显微镜 ]，搜狐，2018-07-05</ref> 。他们将双光子吸收的概念与使用激光扫描仪相结合。在双光子激发显微镜中，红外激光束通过物镜聚焦。 通常使用的钛-蓝宝石激发激光具有大约100飞秒的脉冲宽度和大约80MHz的重复率，允许两个光子吸收所需的高光子密度和通量，并且可以在宽波长范围内调节。 具有325fs脉冲的锁模的Yb掺杂[[光纤激光器]]也已用于胶原成像，证明[[胶原蛋白]]的穿透深度超过320μm，这相当于当耦合到传统钛-[[蓝宝石]]激发激光时可实现的250-300 μm的深度。