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腰椎穿刺手續常在局部麻醉和消毒後進行。然後，一根針管會被插入蛛網膜下腔，並收集腦脊液。收集到的液體可以被用在生物化學、微生物學和細胞病理學分析。

腰椎穿刺的作用可以是協助診斷或者疾病治療。其診斷用途是對腰椎穿刺時獲得的腦脊液的化驗可以用於排除中樞神經系統中的感染、炎症、和腫瘤類疾病。其中最為重要的一項是排除或確診腦膜炎，因為腦膜炎是一種極為危險但容易治療的疾病，而其除了腰椎穿刺之外，沒有其他可靠的手段可以確診。腰椎穿刺也可以用於診斷患者是否患有1型或2型布魯士錐形蟲病。