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重组细胞因子基因蛋白衍生注射液案例重组细胞因子基因蛋白衍生注射液案例--【新型冠状病毒肺炎】，乐复能治疗慢性乙型肝炎的临床研究，先后列入国家“十一五”和“十二五”重大新药创制科技重大专项。杰华生物申报的NCE类药物乐复能（通用名：重组细胞因子基因衍生蛋白注射液）（以下简称“乐复能”），于2018年4月正式获得国家新药注册批准（国药证字S20180001，国药准字S20180002），乐复能成为世界上近30年来发明的全新种类的乙型肝炎治疗药物，是除核苷类抗病毒药物和人干扰素（普通和长效）药物外的第三类乙型肝炎治疗药物。

乐复能是一种非天然的蛋白，是在10多种人干扰素α 基因基础上，利用DNA shuffling技术筛选获得的蛋白质；它由166 个氨基酸组成，分子量为19.3kDa，与人干扰素α -2b的相似性为81%（氨基酸序列）；利用前述发明的新基因，通过 E.Coli表达纯化获得的生物药；其主要作用是抗病毒、免疫调节和抑制细胞增殖。

自2019年年底COVID-19疫情暴发以来，全世界的疫情仍在发展。截止2021年8月5日，全世界确诊病例数达到约2.0亿，其中死亡病例约426万，成为全人类的重大灾难。自2020年新冠爆发以来，世界主要国家政府及药监机构均设立特别政策和途径，简化新冠药物审批流程和要求，以便加快和促进特效抗新冠病毒药物研发。自2020年新冠流行开始，杰华生物就完成了乐复能抑制新冠病毒（SARS-CoV-2）复制的实验室研究，以及雾化吸入乐复能治疗普通型新冠的II期临床研究，观察到乐复能可以加快新冠患者的病毒清除，初步证明乐复能具有抗新冠病毒的治疗效果。

案例关键词：重组细胞因子基因衍生蛋白注射液、乐复能、基因穿梭法、HBV、创新、高活性、SARS-CoV-2、COVID-19

研发背景

重组细胞因子基因衍生蛋白注射液是由留学海外的华人科学家团队在美国、加拿大经过18年潜心研究获得的新型抗病毒蛋白药物，其活性成分重组细胞因子基因衍生蛋白系采用基因穿梭法（DNA Shuffling）、从12种人α干扰素基因构建杂交文库、采用高通量筛选技术、筛选10多万个克隆而得到的高活性新型蛋白，由498个核苷酸编码166个氨基酸组成，分子量为19.3 kD，已经取得了美国专利。与人IFN-α14在碱基和氨基酸序列上同源性最高，同源性分别达到92%和86%，与人IFNα-2b在碱基和氨基酸序列上同源性分别为89%（445/498）和81%（135/166）。

中国药品生物制品标准化研究中心检测结果显示，采用《中国药典》推荐的干扰素抗病毒活性检测方法—WISH-VSV细胞病变抑制法测定，其抗病毒比活性是目前已上市的重组人干扰素α-2b的10倍。

临床前研究

药效学研究

体外活性检测结果显示，用公认的WISH-VSV细胞病变抑制法测定抗病毒活性，重组细胞因子基因衍生蛋白注射液的比活性平均值为1.34×109U/mg，对照品重组人干扰素α2b的比活性平均值为1.34×108U/mg，重组细胞因子基因衍生蛋白注射液的抗病毒比活性较是上市对照品的10倍。

在体外对多个类型的病毒株进行了抗病毒活性检测。体外抗HBV研究，以拉米夫定为阳性对照药，用实时荧光定量PCR法（Taqman探针法）观察重组细胞因子基因衍生蛋白注射液和干扰素α-2b对HepG2.2.15细胞培养上清和细胞中HBV DNA含量的影响。结果显示重组细胞因子基因衍生蛋白注射液可显著降低培养上清和细胞内HBV DNA水平，提示其具有明确的抗HBV复制作用。体外抗HCV的研究，利用Huh7杆细胞系，检测在加入样品72小时后用实时定量PCR试剂检测HCV RNA拷贝数，HCV复制子为pNneo/3-5BRG(HCV-N(1b)复制子。结果显示重组细胞因子基因衍生蛋白注射液呈剂量依赖性抑制HCV的RNA拷贝数。体外抗HIV研究，在MT4细胞培养体系中，采用细胞病变法（CPE）和ELISA检测培养细胞上清中p24表达水平，观察重组细胞因子基因衍生蛋白注射液对HIV复制的影响。结果显示，重组细胞因子基因衍生蛋白注射液具有明显的抗HIV-1活性，作用明显强于甘乐能（进口干扰素）。体外抗H5N1的研究，在A549细胞模型中，病毒株为H5N1哈尔滨01株，用细胞病变法检测重组细胞因子基因衍生蛋白注射液抗H5N1活性，结果重组细胞因子基因衍生蛋白注射液对H5N1致A549细胞病变有明显的抑制作用，干扰素α-2b作用较弱。

重组细胞因子基因衍生蛋白注射液和受体IFNＲ1的相互作用力有了明显的提高，结合位点数更多。与博奥生物有限公司/生物芯片北京国家工程研究中心公司合作，采用全基因组芯片，研究乐复能诱导表达的靶基因和激活的信号通路，并与干扰素α-2b进行比较，结果发现乐复能诱导表达的靶基因数量远多于干扰素α-2b，几乎包含了干扰素诱导的所有靶基因表达，但乐复能可以激活很多干扰素不能作用的信号通路，激活的信号通路包括细胞周期、细胞凋亡、抗炎免疫、抗原识别和提呈、抗病毒等。

体外抗SARS-CoV-2病毒活性

本研究在中国疾病预防控制中心（中国CDC）的生物安全3级（BSL3 / P3）实验室进行。Vero E6细胞（非洲绿猴肾细胞，ATCC），SARS-CoV-2病毒株（C-Tan-nCov武汉菌株01）。将96孔板中的空白Vero E6细胞（每孔1 x 104个）与C-Tan-nCov武汉菌株01（100 PFU）共培养2小时，以诱导SARS-CoV-2感染的细胞。去除含病毒的上清液后，加入具有不同浓度乐复能（0、0.001、0.01、0.1、1,10或100ng /mL）的培养基，然后将细胞培养24小时以让病毒复制。24小时后，从每个孔采集100μL上清液，并提取出病毒RNA并进行测定。使用Takara Bio的One Step Prime Script实时PCR（RT-PCR）试剂盒来检测病毒RNA拷贝数。获得定量实时PCR循环阈值（Ct），并计算不同乐复能浓度下的病毒复制抑制率。再进一步用乐复能处理Vero E6细胞，随后暴露于SARS-CoV-2时，观察乐复能能否阻止该病毒进入细胞。将Vero E6细胞与一系列浓度的乐复能培养2小时，然后除去含有乐复能的上清液，加入C-Tan-nCov武汉菌株01（100PFU）培养2小时，使其暴露于SARS-CoV-2，然后除去含有SARS-CoV-2的上清液。添加新鲜培养基，并将这些细胞培养48小时。从每个孔中取100μL上清液，并使用与前述同样方法测量上清液中的病毒RNA拷贝数。

结果显示，乐复能抑制SARS-Cov-2 复制的半数有效浓度（EC50）为1.02 ng / ml。该乐复能浓度对Vero E6细胞显示出最小的细胞毒性，半数细胞毒性浓度（CC50）超过100ng / ml。治疗指数（CC50 / EC50）超过98。乐复能的预防健康细胞感染作用的EC50为0.1ng/ml，结果表明复能可以抑制感染细胞内的SARS-CoV-2的病毒复制，预防健康细胞遭受病毒感染。