[[File: 双光子激发显微镜 （英语：Two-photon excitation microscopy）是一种荧光成像技术，可以对活体组织进行深度约1毫米的成像。 它不同于传统的荧光显微镜，其中激发波长短于发射波长，因为两个激发光子的波长长于所得发射光的波长。 .jpeg|有框|右|<big> 双光子激发显微 术通常使用近红外激发光，其也可以激发荧光染料。 镜</big>[http://www.ibp.cas.cn/kxyjpt/sgzxwj/200903/W020090320463607234619.jpg 原图链接][http://www.ibp.cas.cn/kxyjpt/sgzxwj/ 然而，对于每次激发，两个光子的红外光被吸收。 来自 使用红外线可最大限度地减少组织 中 的散射。 由于多光子吸收，背景信号被强烈抑制。 国科学院生物物理研究所 这两种效果都会导致这些显微镜的穿透深度增加。 由于其更深的组织穿透，有效的光检测和减少的光漂白，双光子激发可以是共聚焦显微镜 的 优越替代品。图片]]]

借助于强聚焦 '''双光子 激 发显微镜'''（英语：Two-photon excitation microscopy）是一种荧 光 束 成像[[技术]] ， 产生非线性 可以对活体组织进行深度约1毫米的成像。它不同于传统的荧 光 学效应 显微镜 ，其 基 中激发波长短 于 同时到达一 发射波长，因为两 个 分 激发光 子 中 的 若干 波长长于所得发射光的波长。 双 光子 （ 激发显微术通常使用近红外激发光，其也可以激发荧光染料。然而，对于每次激发，两个 光 粒 子 ） 的 相互作 红外光被吸收。使 用 [[红外线]]可最大限度地减少组织中的散射 。 因此 由于多光子吸收 ， 所产生的 背景 信号 的 被 强 度不 烈抑制。这两种效果都 会 随着照射光子 导致这些[[显微镜]] 的 数量而线性 穿透深度 增加 。 由于其更深的组织穿透，有效的光检测和减少的光漂白 ， 而是与平方率（对于 双光子 效应）或立方率（对于三光子效应）一致 激发可以是共聚焦显微镜的优越替代品 。

借助于强聚焦激光束，产生非线性[[光学]]效应，其基于同时到达一个分子中的若干光子（光粒子）的相互作用。 因此，所产生的信号的强度不会随着照射[[光子]]的数量而线性增加，而是与平方率（对于双光子效应）或立方率（对于三光子效应）一致。 多光子显微镜的操作类似于 [[激光扫描共聚焦显微镜| 共聚焦激光扫描显微镜 ]]<ref>[https://www.sohu.com/a/403805446_680608 【科研方法】激光扫描共聚焦显微镜技术使用指南]，搜狐，2020-06-24 </ref> 的操作。 然而，虽然共聚焦激光扫描显微具有50-80 μm的穿透深度，取决于制剂，可以与多光子显微镜一起使用更深的区域，例如，200 μm，在非常有利的情况下甚至可达到1000 μm（= 1 mm）。 活体组织的这一图像可能是用其它方法无法成像。

双光子激发采用双光子吸收，这一 [[ 概念 ]] 首先由玛丽亚·格佩特-梅耶（1906-1972年）在1931年的博士论文中描述，并且首次在1961年被Wolfgang凯撒（Wolfgang Kaiser (physicist)）使用激光激发在CaF2：Eu2 +晶体中观察到。 艾萨克·阿贝拉（Isaac Abella）于1962年在铯蒸气中表明，双光子激发单个 [[ 原子 ]] 是可能的。

双光子显微镜由温弗里德·登克(Winfried Denk)和James Strickler于1990年在 [[ 康奈尔大学 ]] 的瓦·韦伯(Watt W. Webb)实验室开创并获得 [[ 专利 ]]<ref>[https://www.sohu.com/a/239429211_650136 程和平院士专访 | 自主研发微型化双光子显微镜 ]，搜狐，2018-07-05</ref> 。他们将双光子吸收的概念与使用激光扫描仪相结合。在双光子激发显微镜中，红外激光束通过物镜聚焦。 通常使用的钛-蓝宝石激发激光具有大约100飞秒的脉冲宽度和大约80MHz的重复率，允许两个光子吸收所需的高光子密度和通量，并且可以在宽波长范围内调节。 具有325fs脉冲的锁模的Yb掺杂 [[ 光纤激光器 ]] 也已用于胶原成像，证明 [[ 胶原蛋白 ]] 的穿透深度超过320μm，这相当于当耦合到传统钛- [[ 蓝宝石 ]] 激发激光时可实现的250-300 μm的深度 。