雙向電泳

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雙向電泳是中國的一個科技名詞。

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目錄

名詞解釋

雙向電泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）是等電聚焦電泳和SDS-PAGE的組合，即先進行等電聚焦電泳（按照pH分離），然後再進行SDS-PAGE（按照分子大小），經染色得到的電泳圖是個二維分布的蛋白質圖。蛋白質組研究的發展以雙向電泳技術作為核心。雙向電泳由O』Farrell’s於1975年首次建立並成功地分離約1 000個E.coli蛋白，並表明蛋白質譜不是穩定的，而是隨環境而變化。雙向電泳原理簡明，第一項進行等電聚焦，蛋白質沿pH梯度分離，至各自的等電點；隨後，再沿垂直的方向進行分子量的分離。

原理

蛋白質首先在薄條凝膠中通過等電聚焦分離。然後將凝膠水平放置在第二個平板狀凝膠上，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質。水平分離反映了pI的差異；垂直分離反映了分子量的差異。因此，原始的蛋白質組成在兩個維度上擴散。使用雙向電泳技術可以分解數千種細胞蛋白質。可以從凝膠中切取出單個蛋白質點，並通過質譜進行鑑定。

研究方向

隨着技術的飛速發展，已能分離出10 000個斑點（spot）。 當雙向電泳斑點的全面分析成為現實的時候，蛋白質組的分析變得可行。

樣品製備（sample prepareation）和溶解同樣事關2-DE的成效，目標是儘可能擴大其溶解度和解聚，以提高分辨率。用化學法和機械裂解法破碎以儘可能溶解和解聚蛋白，兩者聯合有協同作用。對IEF（isoelectric focusing）樣品的預處理涉及溶解、變性和還原來完全破壞蛋白間的相互作用，並除去如核酸等非蛋白物質。理想的狀態是人們應一步完成蛋白的完全處理。而離液劑2 mol/L硫脲和表面活性劑4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG（immobilized pH gradients）膠上的轉換。三丁基膦（Tributyl phosphine，TBP）取代β-巰基乙醇或DTT完全溶解鏈間或鏈內的二硫鍵，增強了蛋白的溶解度，並導致轉至第二向的增加]。兩者通過不同的方法來增加蛋白的溶解度，作為互補試劑會更有效。在保持樣品的完整性的前提下，可利用超離和核酸內切酶去除核酸（DNA）。除此之外，機械力被用來對蛋白分子解聚，如超聲破碎等。另外，添加PMSF等蛋白酶抑制劑，可保持蛋白完整性。由於商品化的IPG膠條是乾燥脫水的，可在其水化的過程中加樣，覆蓋整個IPG膠，避免在樣品杯中的沉澱所致的樣品丟失。此外，低豐度蛋白（low abundance protein）在細胞內可能具有重要的調節功能，代表蛋白質組研究的「冰山之尖」，故分離低豐度蛋白是一種挑戰。亞細胞分級和蛋白質預分級、提高加樣量（已達到1～15 mg級的標準）、應用敏感性檢測，可以提高其敏感性。如一種多肽免疫2-DE印跡（MI-2DE）是利用幾種單克隆抗體技術來分析和檢測。提高組蛋白和核糖體蛋白等鹼性蛋白（basic proteins）的分離是另一難點。由於鹼性pH範圍內凝膠基質的不穩定及逆向電滲流（EOF）的產生，對PI（等電點）超過10的鹼性蛋白，通過產生?0～10%?的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之。亦可用雙甲基丙烯酰胺來增加基質的穩定性。

挑戰

2-DE面臨的挑戰是高分辨率和重複性。高分辨率確保蛋白最大程度的分離，高重複性允許進行凝膠間配比（match）。對2-DE而言，有3種方法分離蛋白：1）ISO-DALT（isoelectric focus）以O』Farrell’s技術為基礎。第一向應用載體兩性電解質（carrier ampholyte,CA），在管膠內建立pH梯度。隨着聚焦時間的延長，pH梯度不穩，易產生陽極漂移。2） NEPHGE（non-equilibrium pH gradient electrophoresis）用於分離鹼性蛋白（pH>7.0）。如果聚焦達到平衡狀態，鹼性蛋白會離開凝膠基質而丟失。因此，在等電區域的遷移須在平衡狀態之前完成，但很難控制。3）IPG-DALT發展於80年代早期。由於固相pH梯度（Immobilized pH gradient,IPG）的出現解決了pH梯度不穩的問題。IPG通過immobiline共價偶聯於丙烯酰胺產生固定的pH梯度，克服了IEF的缺點，從而達到高度的重複性。可以精確製作線性、漸進性和S型曲線，範圍或寬或窄的pH梯度。新的酸性pH 3～5或鹼性pH 6～11的IPG凝膠梯度聯合商品化的pH 4～7的梯度可對蛋白質形成蛋白質組重疊群（proteomic contigs）從而有效分離。