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| 基因探針 |
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基因探針 即核酸探針，是一段帶有檢測標記，且順序已知的，與目的基因互補的核酸序列(DNA或RNA)。基因探針通過分子雜交與目的基因結合，產生雜交信號，能從浩瀚的基因組中把目的基因顯示出來。根據雜交原理，作為探針的核酸序列至少必須具備以下兩個條件:①應是單鏈，若為雙鏈，必須先行變性處理。②應帶有容易被檢測的標記。它可以包括整個基因，也可以僅僅是基因的一部分;可以是DNA本身，也可以是由之轉錄而來的RNA。
基本信息
中文名稱 基因探針 [1]
外文名稱 probe
又稱 核酸探針 [2]
簡稱 探針
屬性 DNA或者RNA
來源
DNA探針根據其來源有3種:一種來自基因組中有關的基因本身，稱為基因組探針(genomic probe);另一種是從相應的基因轉錄獲得了mRNA，再通過逆轉錄得到的探針，稱為cDNA探針(cDNA probe)。與基因組探針不同的是，cDNA探針不含有內含子序列。此外，還可在體外人工合成鹼基數不多的與基因序列互補的DNA片段，稱為寡核苷酸探針。
製備
進行分子突變需要大量的探針拷貝，後者一般是通過分子克隆(molecular cloning)獲得的。克隆是指用無性繁殖方法獲得同一個體、細胞或分子的大量複製品。當製備基因組DNA探針前，應先製備基因組文庫，即把基因組DNA打斷，或用限制性酶作不完全水解，得到許多大小不等的隨機片段，將這些片段體外重組到運載體(噬菌體、質粒等)中去，再將後者轉染適當的宿主細胞如大腸肝菌，這時在固體培養基上可以得到許多攜帶有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通過原位雜交，從中可篩出含有目的基因片段的克隆，然後通過細胞擴增，製備出大量的探針。
為了製備cDNA 探針，首先需分離純化相應mRNA，這從含有大量mRNA的組織、細胞中比較容易做到，如從造血細胞中製備α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板後，在逆轉錄酶的作用下，就可以合成與之互補的DNA(即cDNA)，cDNA與待測基因的編碼區有完全相同的鹼基順序，但內含子已在加工過程中切除。
寡核苷酸探針是人工合成的，與已知基因DNA互補的，長度可從十幾到幾十個核苷酸的片段。如僅知蛋白質的氨基酸順序量，也可以按氨基酸的密碼推導出核苷酸序列，並用化學方法合成。
標記
為了確定探針是否與相應的基因組DNA雜交，有必要對探針加以標記，以便在結合部位獲得可識別的信號,通常採用放射性同位素32P標記探針的某種核苷酸α磷酸基。但近年來已發展了一些用非同位素如生物素-親合素系統
、地高辛配體等作為標記物的方法。非同位素標記的優點是保存時間較長,而且避免了同位素的污染。最常用的探針標記法是缺口平移法(nick translation)。首先用適當濃度的DNA酶Ⅰ(DNAseⅠ)在探針DNA雙鏈上造成缺口，然後再藉助於DNA聚合酶Ⅰ(DNa poly merasⅠ)的5'→3'的外切酶活性，切去帶有5'磷酸的核苷酸;同時又利用該酶的5'→3'聚酶活性，使32P標記的互補核苷酸補入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的這兩種活性的交替作用，使缺口不斷向3'的方向移動，同時DNA鏈上的核苷酸不斷為32P標記的核苷酸所取代。
探針的標記也可以採用隨機引物法，即向變性的探針溶液加入6個核苷酸的隨機DNA小片段，作為引物，當後者與單鏈DNA互補結合後，按鹼基互補原則不斷在其3'OH端添加同位素標記的單核苷酸，這樣也可以獲得比放射性很高的DNA探針。
DNA探針
DNA探針是以病原微生物DNA或RNA的特異性片段為模板，人工合成的帶有放射性或生物素標記的單鏈DNA片段，可用來快速檢測病原體。DNA探針將一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或熒光染料等標記後製成的探針。可與固定在硝酸纖維素膜的DNA或RNA進行互補結合，經放射自顯影或其他檢測手段就可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在。
DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百鹼基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針。現已獲得DNA探針數量很多，有細菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細菌的毒力因子基因探針和人類Alu探針。這些DNA探針的獲得有賴於分子克隆技術的發展和應用。以細菌為例，分子雜交技術用於細菌的分類和菌種鑑定比之G+C百分比值要準確的多，是細菌分類學的一個發展方向。加之分子雜交技術的高敏感性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。細菌的基因組大小約5×106bp，約含3000個基因。各種細菌之間絕大部分DNA是相同的，要獲得某細菌特異的核酸探針，通常要採取建立細菌基因組DNA文庫的辦法，即將細菌DNA切成小片段後分別克隆得到包含基因組的全信息的克隆庫。然後用多種其它菌種的DNA作探針來篩選，產生雜交信號的克隆被剔除，最後剩下的不與任何其它細菌雜交的克隆則可能含有該細菌特異性DNA片段。將此重組質粒標記後作探針進一步鑑定，亦可經DNA序列分析鑑定其基因來源和功能。因此要得到一種特異性DNA探針，常常是比較繁瑣的。探針DNA克隆的篩選也可採用血清學方法，所不同的是所建DNA文庫為可表達性，克隆菌落或噬斑經裂解後釋放出表達抗原，然後用來源細菌的多克隆抗血清篩選陽性克隆，所得到多個陽性克隆再經其它細菌的抗血清篩選，最後只與本細菌抗血清反應的表達克隆即含有此細菌的特異性基因片段，它所編碼的蛋白是該菌種所特有的。用這種表達文庫篩選得到的顯然只是特定基因探針。
對於基因探針的克隆尚有更快捷的途徑。這也是許多重要蛋白質的編碼基因的克隆方法。該方法的第一步是分離純化蛋白質，然後測定該蛋白的氨基或羥基末端的部分氨基酸序列，然後根據這一序列合成一套寡核苷酸探針。用此探針在DNA文庫中篩選，陽性克隆即是目標蛋白的編碼基因。值得一提的是真核細胞和原核細胞DNA組織有所不同。真核基因中含有非編碼的內含子序列，而原核則沒有。因此，真核基因組DNA探針用於檢測基因表達時雜交效率要明顯低於cDNA探針。DNA探針(包括cDNA探針)的主要優點有下面三點:①這類探針多克隆在質粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，製備方法簡便。②DNA探針不易降解(相對RNA而言)，一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探針的標記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機引物法，PCR標記法等，能用於同位素和非同位素標記。
DNA探針可以用來診斷寄生蟲病，現場調查及蟲種鑑定，可用於病毒性肝炎的診斷，遺傳性疾病的診斷，可用於檢測飲用水病毒含量。具體方法:用一個特定的DNA片段製成探針，與被測的病毒DNA雜交，從而把病毒檢測出來。與傳統方法相比具有快速、靈敏的特點。傳統的檢測一次，需幾天或幾個星期的時間，精確度不高，而用DNA探針只需一天。據報道，能從1t水中檢測出10個病毒來，精確度大大提高。
RNA探針
RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由於RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應效率極高。早期採用的RNA探針是細胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細胞基因轉錄或病毒複製過程中得到標記的，標記效率往往不高，且受到多種因素的制約。這類RNA探針主要用於研究目的，而不是用於檢測。例如，在篩選逆轉錄病毒人類免疫缺陷病毒(HIV)的基因組DNA克隆時，因無DNA探針可利用，就利用HIV的全套標記mRNA作為探針，成功地篩選到多株HIV基因組DNA克隆。又如進行中的轉錄分析(nuclearrunontranscrip-tionassay)時，在體外將細胞核分離出來，然後在α-32P-ATP的存在下進行轉錄，所合成mR-NA均摻入同位素而得到標記，此混合mRNA與固定於硝酸纖維素濾膜上的某一特定的基因的DNA進行雜交，便可反映出該基因的轉錄狀態，這是一種反向探針實驗技術。
體外轉錄技術不斷完善，已相繼建立了單向和雙向體外轉錄系統。該系統主要基於一類新型載體pSP和pGEM，這類載體在多克隆位點兩側分別帶有SP6啟動子和T7啟動子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可以進行RNA轉錄，如果在多克隆位點接頭中插入了外源DNA片段，則可以此DNA兩條鏈中的一條為模板轉錄生成RNA。這種體外轉錄反應效率很高，在1h內可合成近10μg的RNA產生，只要在底物中加入適量的放射性或生物素標記的NTP，則所合成的RNA可得到高效標記。該方法能有效地控制探針的長度並可提高標記物的利用率。
值得一提的是，通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉錄方向，即以哪條DNA鏈以模板轉錄RNA。這種可以得到同義RNA探針(與mRNA同序列)和反義RNA探針(與mRNA互補)，反義RNA又稱cRNA，除可用於反義核酸研究外，還可用於檢測mRNA的表達水平。在這種情況下，因為探針和靶序列均為單鏈，所以雜交的效率要比DNA-DNA雜交高几個數量級。RNA探針除可用於檢測DNA和mRNA外，還有一個重要用途，在研究基因表達時，常常需要觀察該基因的轉錄狀況。在原核表達系統中外源基因不僅進行正向轉錄，有時還存在反向轉錄(即生成反義RNA)，這種現象往往是外源基因表達不高的重要原因。另外，在真核系統，某些基因也存在反向轉錄，產生反義RNA，參與自身表達的調控。在這些情況下，要準確測定正向和反向轉錄水平就不能用雙鏈DNA探針，而只能用RNA探針或單鏈DNA探針。