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工具酶

[1]來自 搜狗 的圖片

基因工程的關鍵技術是脫氧核糖核酸的連接和重組，在此過程中一些酶起着至關重要的作用，這些酶統稱為基因工程工具酶。工具酶種類繁多、功能各異，主要包括限制酶、聚合酶、連接酶、修飾酶和核酸酶五大類。其中，以限制性核酸內切酶和DNA連接酶在分子克隆中的作用最為突出。這些酶具有特異性的序列識別能力以及高效的生物催化活性，在一定的條件下可以對核酸分子進行切割、連接、擴增以及修飾等，同時工具酶的反應條件溫和且具有出色的生物相容性。基於這些優勢，工具酶被廣泛地應用於核酸、蛋白質和小分子等生物活性分子的分析檢測。

分類

1、DNA限制性內切酶

生物體內能識別並切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。它是可以將外來的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入並使之失去活力，但對自己的DNA卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息。由於這種切割作用是在DNA分子內部進行的，故名限制性內切酶(簡稱限制酶)

限制性內切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA內切酶之分，Ⅱ型能嚴格識別核酸序列，並在識別區內特定的核苷酸處切開DNA雙鏈。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA內切酶。識別分四核苷酸，五核苷酸，八核苷酸和六核苷酸，其中以六核苷酸為主，其序列旋轉對稱。切口分黏性末端和平末端，產生3′－OH和5′－P末端。內切酶品種多，使用時應注意溫度、緩衝液用量（一般1μg DNA/2-5單位酶）等反應條件。

2、連接酶

它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，藉助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。

連接酶有T4噬菌體DNA連接酶、T4噬菌體RNA連接酶、大腸埃希菌DNA連接酶等。DNA連接酶可連接平端，也連接粘端。反應需有Mg2+和ATP存在，pH7.5-7.6。最適溫度37℃，30℃以下活性明顯下降，但考慮到被連接DNa 的穩定性和粘性末端的退火溫度，一般平端連接用20-25℃，粘端連接用12℃左右。

聚合酶有DNA聚合酶（以DNA為模板合成DNA大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌體DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA為模板合成RNA，T7或T3噬菌體RNA聚合酶）；逆轉錄酶（以RNA為模板合成DNA，除RNA病毒中發現外，發現大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆轉錄活性）。

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′，3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草桿菌酶作用產生的一個大片段，有5′→3′聚合酶和3′→5′外切酶活性，無5′→3′外切酶活性。可用於缺口翻譯（Nick translation）法標記核酸，也可用於DNA序列測定，修補DNA鏈等。

3、聚合酶

又稱DNA聚合酶。系專司生物催化合成脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的一類酶的統稱。

可分為以下幾個類群:(1)依賴DNA的DNA聚合酶；(2)依賴RNA的DNA聚合酶；(3)依賴DNA的RNA聚合酶；(4)依賴RNA的RNA聚合酶。前兩者是DNA聚合酶，它使DNA複製鏈按模板順序延長。如在原核生物中僅就大腸桿菌中已被發現的就有三種(分別簡稱為P01Ⅰ，P01Ⅱ和P01Ⅲ等)；DNA聚合酶只能在有引物的基礎上，即在DNA或RNA引物的3′-OH延伸，這DNA的合成方向記為5′→3′。換言之DNA聚合酶催化反應除底物(αNTP)外，還需要Mg2+、模板DNA和引物，迄今細胞內尚無發現可從單體起始DNA的合成。同樣，上述(3)和(4)是催化RNA生物合成反應中最主要的RNA合成酶，它們以四種三磷酸核糖核苷(NTP)為底物，並需有DNA模板以及Mn2+及Mg2+的存在下，在前一個核苷酸3′-OH與下一個核苷酸的5′-P聚合形成3′，5′-磷酸二酯鍵，其新生鏈的方向也是5′→3′。RNA聚合酶也大量存在於原核和真核生物的細胞中。如大腸桿菌RNA聚合酶分子量4.8×105，由5條多肽鏈組成，分別命名為α，α，β，β′，和γ，全酶可用α2ββ′λ表示。真核生物RNA聚合酶分子大於5×105，由10～12個大小不等亞基組成。聚合酶除作為自然界生命活動中不可缺少的組分外，在實驗室中大多用作生命科學研究的工具酶類之一。

4、核酸酶

核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相應的DNA和RNA，核酸酶S1可降解單鏈DNA和RNA，用量增大也可降解雙鏈核酸。它可用於切去ds-cDNA合成中產生的髮夾環。

末端轉移酶在Mg2+存在下，選擇3′－OH端單鏈DNA為引物加成核苷酸，在Co2+存在下，選擇3′－OH端雙鏈DNA為引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。常用於核酸末端標記和核酸連接的互補多聚尾（連接器）。

5、修飾酶

體內有些酶可在其他酶的作用下，將酶的結構進行共價修飾，使該酶活性發生改變，這種調節稱為共價修飾調節(covalent modification regulation)，這類酶稱為修飾酶(prosessing enzyme)。

鹼性磷酸酶去除5′－P，可防止二分子DNA片段5′端P基團自身空間障礙，影響DNA分子之間的連接，一般用鹼性磷酸酶處理載體DNA除去5′端P基團，在連接酶作用下目的基因的5′端P先與載體3′端OH連接，再通過複製修復另一條鏈，使二條鏈完全連接。該方法大大提高了連接效率。

應用

1、核酸檢測

核酸酶是一類對底物核酸具有切刻或者連續消化能力的蛋白酶，自20世紀60年代以來，它常作為一種模型蛋白被廣泛應用於分子生物學的研究中。核酸酶的作用方式和底物特異性都隨着來源的不同而存在差異，根據核酸酶作用位置的不同，將其分為限制性內切酶和核酸外切酶兩種。大多數限制性內切酶可以識別含有迴文序列的雙鏈DNA，並對其兩條核酸鏈均進行切割。同時，限制性核酸內切酶中還有一類特殊的酶稱為切刻內切酶，這類酶只能在特定的酶切位點上對雙鏈DNA中的一條鏈進行酶切水解作用，最終造成一個切口而不是切斷。利用切刻內切酶的這個特殊性質來切割信號探針並反覆循環使用靶核酸鏈，可以實現檢測信號的循環放大，已被廣泛地應用於構建核酸或其它相關靶分子的生物傳感器。

核酸外切酶可以沿着核酸鏈末端依次水解作為核酸骨架的磷酸二酯鍵並生成單核苷酸。依據作用底物單雙鏈的區別，可將核酸外切酶分成兩類，對單鏈具有特異性水解能力的核酸外切酶，如大腸桿菌核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅶ，以及能特異性水解雙鏈的核酸外切酶，如大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ和λ－噬菌體核酸外切酶等。這些酶中還可以根據酶切起點基於微陣列上RNA探針選擇性水解的信號放大技術原理的不同，分為從分子鏈的3′末端或5′末端開始切斷的酶。核酸外切酶Ⅲ作用雙鏈DNA時，沿着3′→5′方向逐步催化去除單核苷酸，沒有特異性的結合位點，但是對雙鏈DNA的3′端突出末端和單鏈不發生水解作用。利用核酸外切酶Ⅲ特異性剪切水解互補3′端的這個特性，在目標物存在時，可將信號分子如染料分子與其猝滅劑分離，恢復熒光信號。進一步循環使用目標物，可放大核酸信號，提高檢測靈敏度。隨着熒光分析的快速發展，大量猝滅劑被應用到基於核酸外切酶Ⅲ的信號放大方法中，如猝滅基團、氧化石墨烯、單壁碳納米管、鈀納米線等。除了使用猝滅回升的信號生成手段，還有核酸外切酶Ⅲ參與量子點－染料熒光共振能量轉移信號放大方法。此外，比色信號、化學發光信號和電化學信號等被引入核酸外切酶參與的信號放大檢測方法，很大程度上拓展了核酸外切酶的應用範圍。另外，科學家將核酸外切酶Ⅲ輔助的靶核酸循環放大技術與流式細胞儀微球相結合，構建了一個快速、可再生的高通量多元核酸同時檢測平台。相比傳統的流式細胞儀微球方法，靈敏度提高58.6%。

2、蛋白質及小分子檢測

1990年，科學家利用SELEX技術成功篩選出了聚合酶的寡核苷酸，為其命名核酸適配體，從此開啟了核酸適配體研究的新時代。核酸適配體是一段能結合不同靶分子的DNA或者RNA序列，它們之間的這種結合能力具有高度特異性和親合力。利用核酸適配體作為轉換器，可以實現核酸檢測與蛋白質及小分子檢測之間輕鬆的轉換，從而將核酸工具酶參與的信號放大方法靈活地應用到蛋白及小分子的檢測當中。與核酸檢測類似，有學者將分子信標上修飾有熒光基團的莖延長，組成一段血小板源生長因子BB的適配子序列。與靶蛋白PDGF-BB結合後，分子信標的二級結構發生改變，引物鏈結合上去，啟動了聚合酶的擴增反應。反應過程中，在形成一條完全互補的DNA雙鏈的同時，改變了適配子的二級結構，靶蛋白脫離出來，進入靶分子循環置換聚合反應，實現靶分子的放大檢 測。為了進一步降低體系的背景，獲得更高的靈敏度，引入氧化石墨烯作為猝滅劑，實現γ-干擾素的高靈敏檢測。除了通過與靶分子結合後探針二級結構改變，暴露出引物鏈的結合序列，觸發酶的複製聚合反應，還可以利用核酸適配子與靶分子的高親和性，競爭出遊離的引物鏈，在模板鏈和聚合酶的作用下，啟動滾環擴增反應，實現靶分子的放大檢測。

3、多重放大技術

為了獲得更高的檢測靈敏度，將多種信號放大技術結合起來使用是一種有效途徑。基於切刻內切酶與DNA聚合酶組合作用的等溫循環鏈置換放大技術，是近年來被廣泛使用的一種工具酶組合信號放大技術。該技術的基本原理是：通過鹼基的互補配對雜交形成切刻內切酶的識別位點後，切刻內切酶在該位點對其中的一條核酸鏈進行切刻作用產生3′端為羥基的切口。聚合酶識別該切口的3′端，以未切割的序列為模板，沿着3′到5′的方向複製聚合置換被切割鏈的另一段序列，最後形成一條完整的雙鏈結構。形成的雙鏈DNA再次被切刻內切酶識別剪切，啟動聚合酶反應。如此「切刻－聚合－置換」的不斷循環，得到大量單鏈核酸結構，從而實現核酸鏈的擴增與信號放大的目的。由於操作簡單、擴增效果顯著，切刻內切酶與DNA聚合酶組合使用的多重放大技術受到很多生化分析科研工作者的青睞。利用該放大技術，科學家設計了一種基於切刻內切酶和DNA聚合酶組合的DNA機器，並將其用於核酸的放大檢測。目標核酸鏈作為DNA機器的「運轉軌道」，與引物結合後，作為模板鏈啟動DNA聚合反應，形成完整的雙鏈DNA。複製擴增出的核酸鏈被切刻內切酶剪切形成切口，在聚合酶的作用下從「運轉軌道」上置換下來，結合有引物鏈的目標核酸鏈，進入「聚合－置換－切刻」的循環過程，利用DNA機器的運轉，產生大量核酸單鏈，最終導致納米金的聚集產生比色信號