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| 肝臟幹細胞 |
人體胚胎髮育早期，前腸末端的肝憩室演化為肝部和尾部兩個部分，其中肝部生長極為迅速，至胚5周時已經充填於腹腔大部。這些向肝臟演化的胚胎樣肝細胞我們稱之為成肝細胞（Hepatoblasts），它不但具有旺盛的增殖能力，而且具有向肝細胞和膽管細胞分化的潛能，所以成肝細胞實際上就是胚胎肝臟幹細胞。只有前腸末端在胚胎髮育中可以被誘導成成肝細胞。4個轉錄因子家族在肝細胞特定分化基因的表達中發揮了重要作用：①具有相同結構域的各種肝細胞核因子1（hepatocyte nuclear factor 1,HNF1）；②系列肝細胞核因子3蛋白（HNF3）；③核受體超家族；④亮氨酸拉鏈家族（C/EBP）。靶細胞在上述轉錄因子的調控下，通過特定基因的表達而產生表型的改變。
胚胎肝臟幹細胞的細胞標誌包括分化標誌如白蛋白（ALB）、甲胎蛋白（AFP）和系列細胞角蛋白（CK7，8，9，14，18，19，20),相關的幹細胞因子和受體如Thy1、Flt3、SCF/ckit、OV6，髓源性幹細胞標誌如CD34等。Taniguchi等［3］基於上述細胞標誌用流式細胞分選法（FACS）成功地對胚胎肝臟幹細胞進行了分離培養，分離的胚胎肝臟幹細胞向同系動物肝臟移植可以分化成肝細胞和膽管上皮細胞，表明胚胎肝臟幹細胞的確具有多向分化潛能。
正常肝臟是否存在幹細胞尚有爭議。有學者基於成熟肝細胞在肝損傷後可以不間斷地恢復增殖能力的特點，提出肝臟本身就是一個「幹細胞池」的觀點。然而根據幹細胞的定義，幹細胞除了具備分裂增殖能力以外，還應具備一定的分化潛能。成熟肝細胞分裂產生的後代細胞仍然是成熟肝細胞，因此從嚴格意義上講，成熟肝細胞不應被看作是幹細胞。
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肝臟幹細胞的功能
肝臟幹細胞能夠補充自身細胞群體，並維持了發育為更特化細胞潛能的細胞，它們為隨着時間的推移為自然喪失細胞的肝臟提供新細胞。
肝臟幹細胞的分化和發育
肝臟肝細胞的分化和發育是一個複雜的過程，如同正常肝細胞再生過程一樣，許多生長因子共同作用而影響它的增殖和分化。其中，TGF-a(轉移生長因子)，HGF(肝細胞生長因子)，aFGF(纖維母細胞生長因子)，HSS(肝刺激物質)都能誘導原始肝細胞的反應0卜。
在AAF／PH模型中，肝切除後，第一個進入DNA合成期的是DV6，desin的膽小管和Ito細胞。伴隨這些細胞出現，可觀察到TGF-a、HGF表達增強，而aFGF表達在於24h後增強，平時無法檢測的TGF-~也可觀察到。所有這些生長因子在肝臟肝細胞整個增殖分化過程中，高水平表達。再生結束後回正常水平。而SCF／C-kit具有惟一肝切除後肝早期再生中輕微短暫的激活作用，它與其他因子相互作用來調節幹細胞增殖，一旦肝卵圓細胞分化成肝細胞，SCF／C-kit的表達就消失了。
在正常的肝臟，肝臟肝細胞處於休眠期，不發生增殖和分裂。當肝臟肝細胞激活以後，也必須在適宜的微環境中才能分化成熟。Dabeva等將分離的肝臟肝細胞分別植入經retrorsine處理和未經其處理的大鼠體內，在實驗組發現植入的肝臟肝細胞分化為肝細胞和膽管細胞，未處理組則沒有明顯分化細胞。在胚胎後期0，肝內胚肝細胞可分化為小肝細胞，位於門脈區，可進一步分化成膽管細胞。在這個分化過程中，CD45的造血幹細胞能誘導胚肝細胞分化，大部分造血幹細胞離開肝臟到達骨髓和脾臟，仍有一小部分造血幹細胞停留於肝內。
但另一方面Hering管細胞表達C-kit拈和(或)CD34，可能是肝內的造血幹細胞或循環到肝內的造血幹細胞遷移到Hering管分化成肝細胞或膽管細胞。在新生兒時期，大部分肝細胞可能是小肝細胞並促使肝臟生長。這些小肝細胞富含線粒體、粗面內質網、過氧化物酶、糖原，胞漿多，一些細胞產生兩個核，隨後發生肝組織重建。在嚴重的肝受損、肝衰竭時，大多數肝細胞死亡和(或)特殊肝毒性處理，肝卵圓細胞迅速增殖、分化成小肝細胞並成熟為肝細胞補充損傷。但當Hering細胞死亡後，肝細胞可由循環中成肝內的造血幹細胞分化而來。在嚙齒類動物中，肝卵圓細胞還可分化成腸道黏膜吸收細胞、杯狀細胞、內分泌細胞和潘氏細胞。
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肝臟幹細胞分離培養
肝臟肝細胞的分離和培養是研究其生物學特點和細胞分化調控的主要手段，同時也為臨床應用提供必要的理論依據。目前誘導肝卵圓細胞激活動物模型中常需：
(1)行2／3PH來引發肝再生。
(2)用D-半乳糖胺(D-GaIN)、四氯化碳(CC1)等造成肝損害。
(3)用各種藥物如2一乙酰氨基芴(2一AAF)、dipin、呋喃(furan)、膽鹼缺乏一乙硫氨酸飲食(CDE)來阻止肝細胞本身的再生。而分離肝臟肝細胞較多採用熒光活化細胞分類法(FACS)，利用流式細胞技術結合免疫熒光標記單克隆技術來分離。
Suzuki等採用FACS方法從13．5d的小鼠胚肝的CD45一TER119一的細胞中篩選出C-kitCD49f細胞和CD49f+CD29細胞，將其植入小鼠脾臟，可以分化成肝細胞。Yasui等從LEC(1ong-EvansCinnamon)大鼠分離肝臟細胞，用各種酶消化大肝細胞，然後通過Percoll液等密度離心可以獲得肝卵圓細胞，經鑑定發現穀氨酰胺轉移酶(GGT)、甲胎蛋白(AFP)、細胞角蛋白(CK)18及19陽性，白蛋白陰性。
另外許多學者致力於肝臟肝細胞培養液的研究，如Brill等的含二甲亞碸激素的限定培養液(建立鼠胚原代肝細胞長期培養方法)和Tateno等的含小牛血清、表皮生長因子、煙酰胺、2一磷酸維生素C及DMSO的培養液(支持肝細胞連續生長卻不失去其增殖和分化功能)等，他們為進一步研究體外培養肝臟肝細胞的特點做了有益的嘗試。
肝臟幹細胞在肝損傷中的運用
肝臟幹細胞在肝臟髒修復損傷的過程中具有重要臨床意義。一般認為肝臟細胞增生性反應可分為：
(1)代償性增生或再生。
(2)肝臟細胞過度增生。
(3)幹細胞增生。其中肝臟幹細胞增生具有特定的臨床研究價值。
Gorclon等研究人員在倒千里光鹼／PH大鼠模型中，在第3天，可以在肝臟中發現被認為是肝臟幹細胞的小肝臟樣祖細胞。這些細胞很小，小於肝臟細胞和對照組中再生的肝臟細胞，它們能在肝臟細胞再生受抑制時快速增生、分化、發育成成熟的肝臟細胞來補充肝臟組織的缺損。Alison等。也發現慢性膽汁淤滯的肝臟髒給予CC1／PH處理後，肝臟卵圓細胞增殖，並進入肝臟實質內形成膽小管，新的膽小管表達膽管上皮角蛋白7，8，18，19，還有波形蛋白。可說明在一定條件下，膽管上皮是有效的潛在的肝臟幹細胞池。在人類肝臟病肝臟細胞早期，門靜脈周圍的肝臟細胞具有祖細胞表型，表達OVo，CK7，19和chrom-A，表明肝臟幹細胞參與肝臟髒再生。
肝臟幹細胞與肝功能的重建
各種原因所導致的急性和亞急性肝細胞壞死，如果肝臟的基本構架尚存，利用肝臟幹細胞無限增殖的特點及其可以向肝細胞和膽管細胞分化的潛力，可望通過人肝臟幹細胞移植來救治患者。
肝臟幹細胞與肝細胞癌的治療
肝癌的發生可能是肝臟幹細胞的分化受阻，據此可以通過改善肝臟的微環境來誘導癌細胞向正常細胞分化，或者誘導癌細胞凋亡來達到治療目的。早在10年前，Coleman報道由大鼠肝臟幹細胞系WBF344惡性轉化的異倍體肝癌細胞株GN6TF和GP7TB向同系大鼠肝內移植，結果GN6TF未發生腫瘤，癌細胞整合到了肝實質內形成了正常的肝板；而GP7TB在肝內仍有成瘤性，但腫瘤在組織形態上分化良好。其結論是肝組織的微環境可以影響癌細胞的分化，消除或減低腫瘤細胞的惡性潛能。目前已有若干體外誘導肝癌細胞系向成熟肝細胞表型分化的實驗報道，但誘導分化的分子機制及臨床應用前景尚有待於進一步的研究。
肝臟幹細胞在臨床上對肝炎病毒的影響
臨床研究發現在急、慢性乙型肝炎和丙型肝炎病人肝臟內均可見典型或不典型的膽小管增生，以慢性活動性肝炎出現最多，急性肝炎出現最少。Ma等通過免疫組化在29例慢性肝病病人(包括19例慢性病毒性肝炎)肝臟尋找肝臟肝細胞，發現肝卵圓細胞主要存在於匯管區和纖維隔內，隨着肝纖維化程度的加重其細胞數顯著增加，特別在肝硬化組織中數量最高。Lowes等「的研究同樣證明肝卵圓細胞數與慢性肝病中炎症的嚴重程度密切相關。Ott等將HBV增強子I和S1啟動子序列轉染原代肝細胞、HBC-3肝祖細胞、鼠胚幹細胞及成纖維細胞，發現HBV序列的轉錄效果是原代肝細胞最強，鼠胚幹細胞及成纖維細胞居中，成纖維細胞未顯示其活性。進一步闡述了肝臟細胞的增生與肝炎病毒密切相關，並且可能標誌着肝細胞癌變的危險性增加。
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肝臟幹細胞的應用前景
1.肝臟幹細胞基礎研究：既然肝癌的發生與肝幹細胞密切相關，那麼可以通過對動物和人的肝幹細胞體內和體外研究，進一步闡明腫瘤的發生機制，希望找到一個揭開腫瘤之謎的途徑。此外肝幹細胞的分化和發育的研究有助於揭示肝臟的發生、發展、成熟的發育學規律。通過研究肝幹細胞分離和培養技術來探討肝臟生理、病理生理及其可能的調控機制，為臨床應用打下理論基礎。
2.肝臟幹細胞移植研究
目前普遍認為肝幹細胞的細胞移植有以下幾個方面
（1）利用肝幹細胞向肝細胞轉化的潛力啟動肝再生，以治療臨床肝功能衰竭；
（2）利用肝幹細胞潛在的造血功能治療各種血液病；
（3）針對細胞癌變和致癌作用來研究相應的抑制或阻斷劑。
由於肝臟幹細胞和造血幹細胞有許多相似的特徵，可考慮將易獲得的造血幹細胞代替肝臟幹細胞，作為肝細胞移植和人工肝新的幹細胞來源。同樣可以在體外將肝臟幹細胞基因修飾後移植給相應基因缺陷的肝臟，使其轉變成正常的肝細胞可用來治療肝代謝性疾病和病毒性疾病。
日本學者在動物實驗中成功分離培養並移植了肝臟幹細胞，確定能合成蛋白質、生成新的肝組織，這個小組將實驗鼠分離培養出幹細胞並增殖。然後，將增殖的數量僅為10萬個(占總數1／2000~3000)移於肝功能衰竭的鼠肝中，40d後發現，肝臟幹細胞發育成新的肝組織，20%-30%癌變的肝組織被新的肝組織置換，新的肝組織能分泌只有肝臟才能分泌的清蛋白，這表明肝功能開始發揮作用。
肝臟幹細胞與基因治療
基因治療是遺傳缺陷性疾病乃至惡性腫瘤最有前途的治療方法，不存在免疫排斥反應，患者無需長期服用免疫抑制藥物。鑑於成熟肝細胞體外培養的限制性，將外源基因導入肝細胞較為因難，而利用幹細胞則較為容易。只要宿主肝細胞生長的微環境良好，經過基因改造的肝臟幹細胞或骨髓幹細胞可望糾正肝臟代謝缺陷性疾病，這種基因修飾的幹細胞自體移植的確顯示了良好的應用前景。
目前，關於肝臟幹細胞研究取得了很大進展，但由於有許多困難，肝臟幹細胞還處於實驗階段。但不久後，其臨床運用的前景將造福於廣大肝病患者。