M13噬菌體檢視原始碼討論檢視歷史

來自 孔夫子舊書網 的圖片

M13噬菌體是全國科學技術名詞審定委員會公布的科技類名詞。

在漢字的歷史上，人們通常把秦代之前留傳下來的篆體文字和象形文字稱為「古文字」，而將隸書和之後出現的字體稱為「今文字」。因此，「隸變」就成為漢字由古體（古文字）演變為今體（今文字）的分界線。

名詞解釋

M13噬菌體是一種絲狀噬菌體，內有一個環狀單鏈DNA分子，長6407個核苷酸，含DNA複製和噬菌體增殖所需的遺傳信息。M13DNA的複製起始位點定位在基因間隔區內。但是基因間隔區的有些核苷酸序列即使發生突變、缺失或插入外源DNA片段，也不會影響M13DNA的複製，這為M13DNA構建克隆載體提供了條件。

其中M13mp系列對野生型M13加以改造，插入了多克隆位點和LacZ基因，可容納外源DNA300-400bp，可用於製備DNA測序時用的單鏈模板和核酸探針。

M13 噬菌體的生物學 M13 噬菌體顆粒是絲狀的，只感染F+（含F質粒，能產生性菌毛）的大腸桿菌。感染宿主後通常不裂解宿主細胞，而是從感染的細胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細胞仍能繼續生長和分裂。但生長水平比未感染組低。

M13 噬菌體的基因組為單鏈 DNA （+DNA），由 6407 的鹼基組成。基因組 90% 以上的序列可編碼蛋白質，共有 11 個編碼基因，基因之間的間隔區多為幾個鹼基。較大的間隔位於基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 以及基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間，其間有調節基因表達和 DNA 合成的元件。

M13 噬菌體基因組可編碼 3 類蛋白質，包括複製蛋白（基因 Ⅱ，Ⅴ 和 Ⅹ），形態發生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ 和 Ⅺ），結構蛋白（基因 Ⅲ 、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ 和 Ⅸ）。所有結構蛋白在形態發生之前都插入在宿主細胞的質膜中。基因組 DNA 為正鏈，按基因 Ⅱ 至基因 Ⅳ 方向合成，與噬菌體的 mRNA 序列同義。

在宿主細胞內，感染性的單鏈噬菌體 DNA （正鏈）在宿主酶的作用下轉變成環狀雙鏈 DNA ，用於 DNA 的複製，因此這種雙鏈 DNA 稱為複製型 DNA （replicative form DNA） ，即 RF DNA 。通過 θ 複製方式， RF DNA 進行擴增，基因的轉錄也隨即開始。基因組中的任意一個啟動子都可以啟動基因的轉錄，單方向地終止於下游的終止子。啟動子和終止子的位置關係使得靠近終止子的基因轉錄更頻繁。

當基因 Ⅱ 蛋白在親代 RF DNA 的正鏈特定位點上產生一個切口時，便啟動噬菌體基因組進行滾環複製。此時，在大腸桿菌的 DNA 聚合酶 Ⅰ 的作用下，以負鏈為模板在切口的 3' 末端加入核苷酸，並持續 DNA 的合成，用新合成的 DNA 替換原有的正鏈。當複製叉環繞模板整整一周時，被取代的正鏈由基因 Ⅱ 產物切去，經環化後形成單位長度的噬菌體基因組 DNA 。在感染開始的 15～20 分鐘內，這些子代正鏈在宿主細胞酶的作用下，又轉變成 RF DNA ，然後以之為模板繼續轉錄並繼續合成子代正鏈 DNA 。當感染細胞內累計有 100-200 個 RF DNA 時，細胞內也產生了足夠的單鏈 DNA 結合蛋白，即基因 Ⅴ 蛋白。該蛋白可以抑制翻譯活性，特別是抑制基因 Ⅱ mRNA 的翻譯，並且強烈地結合在新合成的正鏈 DNA 上，阻止其轉化成 RF DNA 。此時， DNA 的合成幾乎只產生子代正鏈 DNA 。另外，基因 Ⅹ 蛋白和基因 Ⅴ 蛋白也是噬菌體特異 DNA 合成的強力抑制子，從而限制感染細胞內 RF DNA 的數量。結果，感染細胞內 RF DNA 的數目和子代正鏈 DNA 的產生速率都能保持適度。

成熟噬菌體顆粒由 11 個病毒蛋白中的 5 個組成，至少 4 個其他蛋白（如基因 Ⅰ 、Ⅳ 和 Ⅺ 蛋白，以及宿主的硫氧還蛋白（thioredoxin）對噬菌體顆粒的組裝和分泌是必須的。

M13沒有包裝限制：

構建

單鏈 DNA 的酶切和連接是比較困難的，因此 M13 噬菌體在用作載體時是利用其雙鏈 RF DNA。RF DNA 很容易從感染細胞中純化出來，可以象質粒一樣進行操作，並可通過轉化方法再次導入細胞。

（1）載體的插入位點

在 M13 噬菌體基因組中絕大多數為必需基因，只有兩個間隔區可用來插入外源 DNA（基因 Ⅱ/Ⅳ 和基因 Ⅷ/Ⅲ 之間）。基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間的 508bp 間隔區是主要的外源片段插入位點。在基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 之間的小間隔區也可用來插入外源片段，但是在操作過程中，需要獲得感染細胞的菌落進行影印篩選，比利用可見的噬菌斑方法更慢更麻煩。基因 Ⅹ 也可用來克隆外源片段。

（2）M13 噬菌體載體組成

所使用的 M13 噬菌體載體是 Messing 及其同事建立的 mp 系列載體，以基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之間的區域作為外源 DNA 插入區。

mp 載體系列都是從同一個重組 M13 噬菌體 （M13mpl） 改造而來的。在 M13mpl 載體中，間隔區內的 HaeⅢ 位點插入了一小段大腸桿菌 DNA ，引入 α 互補篩選。

（3）M13載體系列

① M13載體系列的命名：M13mpn，n代表系列數字。

② 對M13mp1的改進：加上常用的酶切位點。如B. Gronenborn和J. Messing1978年把LacZ』 5』端的第13個核苷酸G突變成A，產生了一個EcoR I切點，構建成M13mp2。

③ 對M13mp2的進一步改進產生了M13mp系列載體。在M13mp2的LacZ』的5『端加上一段人工合成的多克隆位點（MCS）。如M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19分別對應於pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。

（4）M13mpl8 和 M13mpl9

M13mpl8 和 M13mpl9 這兩個載體含有 13 個不同的酶切位點，可供插入由多種各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段。 M13mpl8 和 M13mpl9 DNA 的全序列已經測定完成，這兩種載體只是在 lacZ 區內不對稱的多克隆區的方向上有所不同。

當 RF DNA 被兩種不同的限制酶切割以後， M13mpl8 和 M13mpl9 輕易不能重新環化。僅當連接混合液中含有帶匹配末端的外源雙鏈 DNA片段時，方可閉合成環。這一片段在 M13mpl8 和 M13mpl9 中將以兩個互為相反的方向插入。這樣一來，在 M13mpl8 的正鏈中含有外源 DNA 雙鏈的其中一條鏈，而在 M13mpl9 正鏈中則含有外源 DNA 的另一條鏈，即 M13mpl8 重組體的子代噬菌體內含有外源 DNA 的一條鏈， M13mpl9 重組體的子代噬菌體內則含有它的互補鏈。故用 M13mpl8 和 M13mpl9 作為一對載體，就可能用一個引物 （通用引物），從所插入 DNA 片段的任一端開始，測定互為相反的兩條鏈的 DNA 序列，並可製備只與外源 DNA 的任意一條鏈互補的 DNA 探針。

優點

（1）有MCS，便於克隆不同的酶切片段。

（2） Xgal顯色反應，可供直接選擇。

（3）無包裝限制，克隆能力大。

（4）可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈（子代M13噬菌體中包含的是單鏈+DNA）。

缺點

① 插入外源DNA後，遺傳穩定性顯著下降。

② 實際克隆能力小於1500bp（雖無包裝限制，並非無限包裝）。