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聚合酶鏈式反應(PCR)是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA複製,PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。因此,無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛髮、皮膚或血液,只要能分離出一丁點的DNA,就能用PCR加以放大,進行比對。這也是「微量證據」的威力之所在。由1983年美國Mullis首先提出設想,1985年由其發明了聚合酶鏈反應,即簡易DNA擴增法,意味着PCR技術的真正誕生。到如今2013年,PCR已發展到第三代技術。1976年,中國科學家錢嘉韻,發現了穩定的Taq DNA聚合酶,為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈,低溫(經常是60°C左右)時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合,再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備,能在變性溫度,復性溫度,延伸溫度之間很好地進行控制。
簡介
Khorana (1971)等最早提出核酸體外擴增的設想:「經DNA變性,與合適的引物雜交,用DNA聚合酶延伸引物,並不斷重複該過程便可合成tRNA基因。」但由於當時基因序列分析方法尚未成熟,熱穩定DNA聚合酶尚未報道以及引物合成的困難,這種想法似乎沒有實際意義。加上分子克隆技術的出現提供了一種克隆和擴增基因的途徑,所以Khorana的設想被人們遺忘了。1983年4月的一個星期五晚上,他開車去鄉下別墅的路上,猛然閃現出「多聚酶鏈式反應」的想法。1983年12月,Mullis用同位素標記法看到了10個循環後的49 bp長度的第一個PCR片段;1985年,Kary Mullis在Cetus公司工作期間,發明了PCR。Mullis要合成DNA引物來進行測序工作,卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1985年10月25日申請了PCR的專利,1987年7月28日批准(專利號4,683,202 ),Mullis是第一發明人;1985年12月20日在Science雜誌上發表了第一篇PCR的學術論文,Mullis是共同作者;1986年5月,Mullis在冷泉港實驗室做專題報告,全世界從此開始學習PCR的方法。
評價
PCR技術的基本原理類似於DNA的天然複製過程,其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成:①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈後,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;③引物的延伸:DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按鹼基互補配對與半保留複製原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留複製鏈,重複循環變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的「半保留複製鏈」,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。[1]