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荧光显微镜要求强烈的，近乎单色光的照明，这是一些普遍的光源，比如卤素灯泡不能提供的。四种主要类型的光源的使用，包括氙气灯或带有激发滤片(Excitation Filter)的水银灯，激光，超连续光谱光源，和高功率发光二极管(LED)。激光被最广泛地用于更复杂的荧光显微技术，像共聚焦显微镜或全内反射萤光显微镜(TIRF)。而氙气灯，水银灯，和发光二极管(LED)与分色激发滤片通常被用于广角落射荧光显微镜(Epi-Fluorescence Microscopes)。