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分子克隆

分子克隆-选殖。原图链接

分子克隆（英语：Molecular cloning，中文译:分子纯化繁殖，简称分子选殖），分子克隆是分子生物学中的一组实验方法，用于组装重组DNA分子并指导其在宿主生物体内复制 。分子克隆通常使用来自两种不同生物的DNA序列：一种是要克隆的DNA的来源；另一种将用作重组DNA复制的活宿主，分子克隆方法对于现代生物学和医学的许多当代领域至关重要。

目录

简介

转基因微生物

分子克隆是分子的纯化繁殖，即分子选殖，“ 克隆 ”一词的使用是指以下事实：该方法涉及复制一个分子以产生具有相同DNA分子的细胞群体。而选殖英文字面上的意思，就是分子复制，定义是指分离一个已知DNA序列，并以in vivo（活体内）方式获得许多复制品的过程。这一复制过程经常被用于增加并获取DNA片段中的基因，但因为这个方法本身使用了基因剪贴的技术，也可用来增加某些任意的DNA序列，如启动子、非编码序列、化学合成的寡核苷酸或是随机的DNA片段。

在常规的分子克隆实验中，要克隆的DNA是从目标生物中获得的，然后在试管中用酶处理以生成较小的DNA片段。随后，这些片段然后与载体DNA结合以产生重组DNA分子。 然后将重组DNA引入宿主生物（通常是易于生长，良性的大肠杆菌细菌实验室菌株）。 这将产生一群生物，其中重组DNA分子与宿主DNA一起复制。 因为它们包含外源DNA片段，所以它们是转基因或转基因微生物（GMO）。

任何DNA序列都可以选殖和扩增

该过程利用了一个事实，即可以诱导单个细菌细胞吸收并复制单个重组DNA分子。 然后可以使该单个细胞按指数方式扩增以产生大量细菌，每个细菌都包含原始重组分子的副本。因此，所得细菌群体和重组DNA分子都通常称为“克隆”。严格来说，重组DNA是指DNA分子，而分子克隆是指用于组装它们的实验方法。提出的想法是，可以将不同的DNA序列插入质粒，并将这些外源序列带入细菌并作为质粒的一部分进行消化。亦即这些质粒可以用作携带基因的克隆载体。

几乎任何DNA序列都可以克隆和扩增，但是有些因素可能会限制该过程的成功。难以克隆的DNA序列的例子是反向重复，复制起点，著丝粒和端粒。限制成功机会的另一个特征是DNA序列的大小。 大于10kbp的插入片段获得的成功非常有限，但是可以修饰噬菌体（例如噬菌体λ）以成功插入高达40 kbp的序列。

历史记录

在1970年代之前，由于无法从复杂的生物体中分离和研究单个基因而严重阻碍了对遗传学和分子生物学的理解。 随著分子克隆方法的出现，这种情况发生了巨大变化。微生物学家试图了解细菌限制细菌噬菌体生长的分子机制，即分离的限制性核酸内切酶 ，这些酶只有在遇到特定的DNA序列时才能切割DNA分子。他们表明限制酶在特定位置切割了染色体长度的DNA分子，并且较大分子的特定部分可以通过大小分级纯化。 使用第二种酶DNA 连接酶 ，可以将限制酶产生的片段连接到称为重组DNA的新组合中。

通过将目标DNA片段与在细菌内部自然复制的载体DNA（例如噬菌体或质粒）重组，可以在细菌培养物中产生大量纯化的重组DNA分子。1972年产生并研究了第一个重组DNA分子。[1] [2]

概述

分子克隆利用了以下事实：DNA在所有活生物体中的化学结构基本相同。 因此，如果将来自任何生物的DNA的任何片段插入到包含DNA复制所需分子序列的DNA片段中，并将所得的重组DNA引入获得复制序列的生物中，则外源DNA将被复制以及转基因生物中宿主细胞的DNA。

分子克隆与聚合酶链反应（PCR）相似，因为它允许复制DNA序列。 两种方法之间的根本区别在于，分子克隆涉及在活微生物中复制DNA，而PCR在没有活细胞的体外溶液中复制DNA。

步骤

在标准分子克隆实验中，任何DNA片段的克隆基本上都涉及以下几个步骤：

  • （1）选择宿主生物和克隆载体。
  • （2）制备载体DNA。
  • （3）制备要克隆的DNA。
  • （4）创建DNA的重组。
  • （5）将重组DNA引入宿主生物。
  • （6）选择含有重组DNA的生物，筛选具有所需DNA插入片段和生物学特性的克隆。

值得注意的是，DNA合成平台的能力和保真度不断提高，使得分子工程学中的设计越来越复杂。 这些项目可能包括很长的新DNA序列炼和/或同时测试整个文库，而不是单个序列。这些变化带来了复杂性，要求设计从基于平面核苷酸的表示形式向更高的抽像水平转变。此类工具的示例包括GenoCAD ，Teselagen 或GeneticConstructor（学术界免费）。

宿主生物和克隆载体的选择

尽管使用了大量的宿主生物和分子克隆载体，但绝大多数分子克隆实验始于实验室细菌大肠杆菌（大肠杆菌）和质粒克隆载体 。大肠杆菌和质粒载体之所以被普遍使用，是因为它们在技术上很先进，用途广泛，用途广泛，并且只需最少的设备即可快速生长重组生物。如果要克隆的DNA非常大（数十万至数百万个碱基对），那么通常会选择细菌人工染色体或酵母人工染色体载体。

专门的应用程序可能需要专门的宿主向量系统。例如，如果实验者希望从重组生物中收获特定蛋白质，则选择表达载体 ，其包含用于在所需宿主生物中转录和翻译的适当信号。或者，如果需要在不同物种中复制DNA（例如，将DNA从细菌转移到植物中），则可以选择多个宿主范围的载体（也称为穿梭载体 ）。然而，实际上，专门的分子克隆实验通常始于克隆到细菌质粒中，然后再亚克隆到专门的载体中。

无论使用宿主和载体的任何组合，载体几乎总是包含四个DNA片段，这些片段对其功能和实验用途至关重要：

  • DNA复制起点是载体（及其连接的重组序列）在宿主生物体内复制所必需的
  • 一个或多个独特的限制性核酸内切酶识别位点 ，用作可能引入外源DNA的位点
  • 可选择的遗传标记基因，可用于使摄取载体序列的细胞存活
  • 标签基因，可用于筛选含有外源DNA的细胞

载体DNA的制备

用限制性核酸内切酶处理克隆载体，以在将要插入外源DNA的位点切割DNA。选择限制酶以在切割位点产生与外源DNA的末端相容的构型。通常，这通过用相同的限制酶例如EcoRI切割载体DNA和外源DNA来完成。 大多数现代载体都包含各种方便的切割位点，这些位点在载体分子内是唯一的（因此，该载体只能在单个位点上被切割），并且位于一个基因（通常是β-半乳糖苷酶 ）中，其失活可以用来区分从非重组生物体中重组而来。 为了提高重组生物与非重组生物的比例，可以使用使载体末端去磷酸化的酶（ 碱性磷酸酶 ）处理裂解的载体。 具有去磷酸化末端的载体分子无法复制，并且只有在将外源DNA整合到切割位点的情况下才能恢复复制。

准备要克隆的DNA

为了克隆基因组DNA，从目的生物中提取要克隆的DNA。 实际上，可以使用任何组织来源（甚至包括灭绝动物的组织），只要DNA不会被广泛降解。 然后使用简单的方法纯化DNA，以去除污染的蛋白质（用苯酚提取），RNA（核糖核酸酶）和较小的分子（沉淀和/或色谱法）。聚合酶链反应（PCR）方法通常用于在分子克隆之前扩增特定的DNA或RNA（RT-PCR）序列。

用于克隆实验的DNA也可以使用逆转录酶（ 互补DNA或cDNA克隆）从RNA中获得，或以合成DNA的形式（ 人工基因合成 ）获得。 cDNA克隆通常用于获得代表目的细胞mRNA种群的克隆，而合成DNA用于获得设计者定义的任何精确序列。当跨遗传密码-例如，从线粒体到细胞核）移动基因时，或者仅通过密码子优化来增加表达时，可能需要这种设计的序列。[3]

然后用限制酶处理纯化的DNA以产生末端能够与载体末端连接的片段。 如有必要，可以添加含有所需限制位点的短双链DNA片段（接头），以创建与载体相容的末端结构。

用DNA连接酶创建重组DNA

在许多方面，重组DNA的产生是分子克隆过程中最简单的步骤。从载体和外源制备的DNA可以简单地以适当的浓度混合在一起，并暴露于将末端共价连接在一起的酶（DNA连接酶 ）中。这种连接反应通常称为连接 。然后准备将包含随机连接末端的所得DNA混合物引入宿主生物中。

DNA连接酶仅识别并作用于线性DNA分子的末端，通常导致末端随机连接的DNA分子的复杂混合物。 将会存在所需的产物（与外源DNA共价连接的载体DNA），但通常还会存在其他序列（例如，与自身连接的外源DNA，与自身连接的载体DNA以及载体和外源DNA的高阶组合）。在将DNA混合物引入细胞后，在克隆过程的后续步骤中分选出这种复杂的混合物。

将重组DNA引入宿主生物

先前在体外操作过的DNA混合物被移回到称为宿主生物的活细胞中。使DNA进入细胞的方法多种多样，在分子克隆过程中此步骤的名称通常取决于所选择的实验方法（例如，转化，转导，转染，电穿孔 ）。

当微生物能够从其本地环境中吸收并复制DNA时，该过程称为转化 ，而处于生理状态以使它们可以吸收DNA的细胞被称为是有能力的。[4]在哺乳动物细胞培养中，将DNA引入细胞的类似过程通常称为转染 。转化和转染通常都需要通过特殊的生长机制和化学处理过程来制备细胞，该过程会随所使用的特定物种和细胞类型而变化。

电穿孔使用高压电脉冲使DNA跨细胞膜[和细胞壁（如果存在）]转移。相反， 转导涉及将DNA包装到病毒衍生的颗粒中，并使用这些病毒样颗粒通过类似于病毒感染的过程将封装的DNA引入细胞。 尽管电穿孔和转导是高度专业化的方法，但它们可能是将DNA移入细胞的最有效方法。

选择含有载体序列的生物

无论使用哪种方法，将重组DNA引入所选宿主生物中通常都是低效率的过程。 也就是说，只有一小部分细胞会真正吸收DNA。 实验科学家通过人工遗传选择的步骤解决了这个问题，在该步骤中，未吸收DNA的细胞被选择性杀死，只有那些能够主动复制含有该载体编码的选择标记基因的DNA的细胞才能存活。

当细菌细胞用作宿主生物时， 选择标记通常是赋予对抗生素的抗性的基因，否则该抗生素会杀死细胞，通常是氨芐青霉素 。带有质粒的细胞在暴露于抗生素后将存活，而那些未能吸收质粒序列的细胞将死亡。 当使用哺乳动物细胞（例如人或小鼠细胞）时，使用类似的策略，除了标记基因（在这种情况下通常编码为kanMX盒的一部分）赋予对抗生素遗传霉素的抗性 。

筛选具有所需DNA插入片段和生物学特性的克隆

现代细菌克隆载体（例如pUC19和后来的衍生物，包括pGEM载体）使用蓝白色筛选系统将转基因细胞的菌落（克隆）与包含亲本载体的菌落（即未插入重组序列的载体DNA）区分开。 在这些载体中，将外源DNA插入编码β-半乳糖苷酶（该酶的活性导致在用于此工作的培养基上形成蓝色菌落）形成的部分的序列中。将外源DNA插入β-半乳糖苷酶编码序列会使酶功能失效，从而使含有转化DNA的菌落保持无色（白色）。 因此，实验人员能够轻松地鉴定和进行转基因细菌克隆的进一步研究，而忽略那些不包含重组DNA的克隆。

在分子克隆实验中获得的单个克隆的总种群通常被称为DNA文库。库可能非常复杂（如从生物体中克隆完整的基因组DNA）或相对简单（如将先前克隆的DNA片段移入其他质粒时），但是几乎总是需要检查许多不同的克隆以确保获得所需的DNA构建体。 这可以通过非常广泛的实验方法来完成，包括使用核酸杂交，抗体探针，聚合酶链反应，限制性片段分析和/或DNA测序 。

应用程序

分子克隆为科学家提供了无限量的，来自任何基因组的任何单个DNA片段。 该材料可用于多种用途，包括基础生物学和应用生物学的目的。这里总结了一些更重要的应用程序。

基因组组织和基因表达

分子克隆直接导致阐明了许多物种基因组的完整DNA序列，并探索了单个物种内的遗传多样性，而这项工作主要是通过确定大量随机DNA序列来完成的。克隆基因组片段，并组装重叠序列。

在单个基因的水平上，分子克隆被用于生成探针，用于检测基因的表达方式，以及该表达方式与生物学中的其他过程（包括代谢环境，细胞外信号，发育，学习，衰老和细胞死亡。 克隆的基因还可以通过允许研究人员使基因失活或使用区域诱变或定点诱变进行更细微的突变，从而提供工具来检查单个基因的生物学功能和重要性。克隆到表达载体中进行功能克隆的基因提供了一种根据表达的蛋白质功能筛选基因的方法。

重组蛋白的生产

获得基因的分子克隆可以导致产生被克隆的基因的蛋白质产物的生物的发展，所述蛋白质产物被称为重组蛋白。在实践中，与克隆基因相比，开发出可产生所需数量的活性形式的重组蛋白的生物通常更加困难。这是因为用于基因表达的分子信号是复杂且可变的，并且因为蛋白质折叠，稳定性和运输可能非常具有挑战性。

当前，许多有用的蛋白质可以作为重组产物获得 。这些包括-

  • （1）具有医学用途的蛋白质，其给药可纠正有缺陷或表达不佳的基因（例如重组凝血因子VIII ，某些形式的血友病缺乏的凝血因子和重组胰岛素 ，用于治疗某些形式的糖尿病）。
  • （2）可用于协助危及生命的紧急情况的蛋白质（例如，用于治疗中风的组织纤溶酶原激活物），
  • （3）重组亚单位疫苗，其中纯化的蛋白质可用于免疫患者的传染病，而无需将其暴露于传染原本身（例如，B型肝炎疫苗）
  • （4）重组蛋白作为诊断实验室测试的标准材料。

转基因生物

一旦进行了表征和操纵以提供适当表达的信号，就可以将克隆的基因插入生物体中，从而产生转基因生物体，也称为转基因生物体（GMO）。尽管大多数转基因生物都是出于基础生物学研究的目的而产生的，但已经开发出许多用于商业用途的转基因生物，其范围从生产药物或其他化合物（制药）的动植物，抗除草剂作物植物和用于家庭娱乐的荧光热带鱼GloFish。

基因疗法

基因治疗涉及向缺乏该功能的细胞提供功能基因，目的是纠正遗传性疾病或获得性疾病。 基因治疗大致可分为两类。 首先是生殖细胞的变化，即精子或卵子的变化，导致整个生物体及其后代的永久性遗传变化。 许多人认为这种“生殖系基因疗法”在人类中是不道德的。第二种基因疗法，即“体细胞基因疗法”，类似于器官移植。 在这种情况下，通过直接治疗或通过去除组织，在实验室中添加一种或多种治疗基因，以及将治疗后的细胞返回给患者来靶向一种或多种特定组织。 体细胞基因疗法的临床试验始于1990年代后期，主要用于癌症，血液，肝脏和肺部疾病的治疗。

尽管进行了大量宣传和承诺，但人类基因治疗的历史一直以相对有限的成功为特征。将基因导入细胞的效果通常只能促进部分和/或暂时缓解所治疗疾病的症状。一些基因治疗试验患者遭受了治疗本身的不利后果，包括死亡。在某些情况下，不良反应是由于插入失活而破坏了患者基因组内必需基因的结果。 在其他情况下，用于基因治疗的病毒载体已被传染性病毒污染。然而，基因治疗仍然被认为是有前途的医学未来领域，并且是一个有大量研究和开发活动的领域。

视频

【消失的国界】基改解药！自然手法“分子选种技术”/李天怡主持/三立新闻台]]
Molecular Cloning Lab(分子克隆实验室)
DNA cloning(DNA克隆)

参考资料

取自“https://pediainside.com/index.php?title=分子克隆&oldid=1442651”